Акция в инвитро 2020: Акции и скидки на анализы и услуги Медицинской компании ИНВИТРО.

Акция в инвитро 2020: Акции и скидки на анализы и услуги Медицинской компании ИНВИТРО.
Июн 06 2021
alexxlab

Содержание

Весенняя акция в ИНВИТРО «Диабет. Узнай вовремя»

Весенняя акция в ИНВИТРО «Диабет. Узнай вовремя»

С 1 марта по 30 апреля 2013 года Независимая лаборатория ИНВИТРО, крупнейшая частная компания на российском рынке лабораторной диагностики, предлагает гражданам России бесплатно проверить уровень глюкозы в крови в рамках акции «Диабет. Узнай вовремя». Акция уже во второй раз проходит в партнёрстве с компанией Johnson&Johnson.

Главная цель проекта ИНВИТРО — увеличить среди населения выявляемость сахарного диабета на ранних стадиях, чтобы предотвратить проявление негативных последствий заболевания.

Проверить уровень глюкозы в крови можно в любом из медицинских офисов сети ИНВИТРО. Одно из важных условий акции — она предназначена только для людей, у которых не поставлен диагноз «сахарный диабет». Пациенту, у которого результаты обследования будут выходить за пределы нормы, дополнительно предложат бесплатно сдать кровь для лабораторного исследования «Гликированный гемоглобин», которое отражает среднее содержание глюкозы в крови за длительный период (до трех месяцев).

Адрес лаборатории ИНВТРО в г. Хабаровске: ул. Запарина 90.

На момент действия акции работает телефон горячей линии 8-800-200-83-53 и промо-сайт diabet.invitro.ru, где можно получить полную информацию о проекте.

ИНВИТРО всегда с большим вниманием относится к медико-социальным проблемам в стране. И этой весной вновь компания ставит перед собой задачу — привлечь внимание соотечественников к такому опасному и коварному заболеванию как сахарный диабет.

По всем дополнительным вопросам, пожалуйста, обращайтесь:

Васин Алексей Юрьевич
Директор Хабаровского филиала
Независимой лаборатории «ИНВИТРО»
моб. :

+7(909) 806-68-86
E-mail: [email protected]
www.invitro.ru
diabet.invitro.ru  

Отзывы 245 пациентов о лаборатории «Инвитро» в Ростове-на-Дону

Согласно имеющимся видеозаписям, список необходимых Вам исследований был проверен совместно с сотрудником, проговорен им вслух и оформлен с Вашего согласия.
Мы искренне сожалеем, однако в ходе проведения проверки мы не обнаружили оснований для удовлетворения Ваших требований о возврате денежных средств за приобретенные и оказанные услуги.
Надеемся, что сложившаяся ситуация не повлияет на наше дальнейшее сотрудничество.
Желаем здоровья и благополучия Вам и Вашим близким!

Команда ИНВИТРО-Ростов-на-Дону.

org/Review»>

+7-989- 51XXXXX

26.02.21 10:16:29

+1.4 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

+7-901- 45XXXXX

09.01.21 13:16:26

-2.0 Ужасно пр-кт Стачки, д. 26 business

+7-903- 46XXXXX

04.01.21 19:51:47

+1.2 Отлично ул. Таганрогская, д. 143 business

+7-928- 62XXXXX

26.12.20 15:36:00

+0.8 Хорошо ул. Таганрогская, д. 143 business

+7-952- 41XXXXX

11.11.20 15:35:21

-0.6 Плохо пр-кт Стачки, д. 26 business

+7-928- 61XXXXX

16.10.20 15:11:43

+0.2 Нормально ул. Рихарда Зорге, д. 52 business

+7-928- 19XXXXX

16.10.20 11:16:24

-1.0 Плохо ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

+7-952- 58XXXXX

30.08.20 11:25:05

-2.0 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

31.08.20 15:59:23

Добрый день. Нам жаль, что Ваш визит в МО Конная Армия вызвал негативное впечатление. К сожалению, вы были записаны на абсолютно другой офис, о чём Вам сообщила Администратор, а так как гарантийные письма по выходным нельзя продублировать, то Вам было отказано в обслуживании. Со своей стороны, менеджеры отдела качества обслуживания, провели подробное изучение общения администратора с Вами. Замечаний выявлено не было. Хотим Вас поблагодарить за обратную связь по работе с гарантийными письма в самое ближайшее время мы изменим данный алгоритм. Доброго здоровья, команда ИНВИТРО.

+7-904- 44XXXXX

26.08.20 10:41:36

+1.5 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

+7-908- 17XXXXX

12.08.20 13:40:35

0.0 Нормально пер. Днепровский, д. 105 business

+7-989- 62XXXXX

26.03.20 15:12:08

+2.0 Отлично ул. Богданова, д. 79 business

+7-991- 80XXXXX

11.03.20 16:10:20

+2.0 Отлично ул. Станиславского, д. 54 business

12.03.20 16:54:11

Добрый день!
Благодарим за обратную связь. Нам важно мнение каждого клиента. Желаем крепкого здоровья Вам и Вашим близким!

С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-988- 51XXXXX

05.03.20 09:42:06

+0.2 Нормально ул. Еременко, д. 97/29 business

06.03.20 15:25:49

Добрый день!
Мы внимательно следим за работой наших сотрудников, поэтому хотели бы более детально разобраться в данной ситуации. Напишите, пожалуйста, нам в социальных сетях (ссылки можно найти на официальном сайте) Ваши ФИО, ИНЗ (указан на чеке и результатах), номер телефона, дату и примерное время обращения в наш медофис, а также ссылку на Ваш отзыв, чтобы мы смогли Вас идентифицировать. Будем благодарны за предоставленную информацию.

С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-960- 45XXXXX

02. 03.20 10:39:15

-2.0 Ужасно ул. Таганрогская, д. 143 business

03.03.20 13:10:57

Добрый день!
Нам очень жаль, что произошла такая ситуация. Для нас ценен каждый клиент. Мы хотели бы разобраться в данной ситуации, поэтому, пожалуйста, напишите нам в социальных сетях (ссылки можно найти на официальном сайте) Ваши ФИО, номер телефона с которого Вы звонили и на который звонили, а также дату и время звонка. Также просим прислать ссылку на Ваш отзыв, чтобы мы смогли Вас идентифицировать. Мы обязательно все выясним и свяжемся с Вами.

С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-918- 53XXXXX

13.02.20 10:21:19

0.0 Нормально ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

14.02.20 14:57:50

Добрый день!
Нам очень жаль, что произошла такая ситуация. Приносим наши искренние извинения. Для нас важно разобраться в случившемся, поэтому, пожалуйста, напишите нам в социальных сетях (ссылки можно найти на официальном сайте) Ваши ФИО, ФИО сына, ИНЗ (он указан на чеке и результатах), номер телефона, дату и примерное время обращения в наш медофис. Также просим прислать ссылку на Ваш отзыв, чтобы мы смогли Вас идентифицировать. Мы проведем проверку и свяжемся с Вами по ее итогам.

С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-906- 75XXXXX

24.01.20 13:27:46

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

27.01.20 16:35:36

Добрый день!
Большое спасибо за Ваш отзыв. Нам очень приятно, что Вы положительно оценили качество нашей работы. Будьте здоровы!

С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-916- 55XXXXX

14.01.20 12:36:57

+2.0 Отлично пер. Днепровский, д. 105 business

15.01.20 15:40:42

Добрый день!
Нам очень приятно, что Вы положительно оценили качество нашей работы.
Мы действительно стараемся сделать наш сервис максимально комфортным для пациентов. Желаем здоровья Вам и Вашим близким.

С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-918- 52XXXXX

11.01.20 16:47:06

+0.8 Хорошо пр-кт Стачки, д. 26 business

13.01.20 15:41:34

Добрый день!
Нам жаль, что произошла такая ситуация. Приносим искренние извинения. Чтобы мы смогли уточнить информацию по данной ситуации, пожалуйста, напишите нам в социальных сетях (ссылки можно найти на официальном сайте), указав Ваши ФИО, ИНЗ (он указан на чеке), номер телефона, дату и примерное время обращения в медофис, номер составленной претензии. Также просим прислать ссылку на Ваш отзыв, чтобы мы смогли Вас идентифицировать. Мы обязательно все выясним и свяжемся с Вами, чтобы сообщить итоги проверки.

С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-909- 41XXXXX

26.12.19 17:28:45

проверено

-2.0 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

22.01.20 15:21:00

Добрый день!
Мы несем полную ответственность за каждый выданный результат, поэтому нам важно разобраться в данной ситуации. Напишите, пожалуйста, нам в социальных сетях (ссылки можно найти на официальном сайте) Ваши ФИО, ИНЗ (он указан на чеке и результатах), номер телефона, дату и примерное время обращения в медофис. Также просим прислать ссылку на Ваш отзыв, чтобы мы смогли Вас идентифицировать и фото результатов альтернативной лаборатории. Мы обязательно проведем проверку по отзыву.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-905- 87XXXXX

19.12.19 13:46:23

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

20.12.19 14:07:59

Добрый день!
Спасибо, что оценили профессионализм наших сотрудников. Желаем Вам здоровья!

С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-989- 13XXXXX

15. 11.19 14:09:00

-1.2 Ужасно пер. Днепровский, д. 105 business

18.11.19 16:49:06

Добрый день!
Нам жаль, что выписанные препараты Вам не подошли. Чтобы мы более детально разобрались в ситуации, напишите нам, пожалуйста, на почту Ваши ФИО, номер телефона, с которого Вы звонили и на который звонили, дату и время звонков, дату приема у врача. Также просим прислать ссылку на Ваш отзыв, чтобы мы смогли Вас идентифицировать. Мы обязательно проведем служебное расследование и свяжемся с Вами по его итогам.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-977- 25XXXXX

13.11.19 17:08:11

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

15.11.19 15:01:14

Добрый день!
Мы очень рады, что Вы остались довольны услугой вызова на дом. Желаем здоровья Вам и Вашим близким.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-951- 59XXXXX

29.10.19 08:29:40

+1.6 Отлично ул. Станиславского, д. 54 business

30.10.19 15:52:47

Добрый день!
Нам жаль, что у Вас сложилось такое мнение. Срок исполнения анализа указан на вашем чеке и не включает день приема биоматериала и выходные дни. Если данный срок был превышен, напишите нам, пожалуйста, на почту Ваши ФИО, ИНЗ(он указан на чеке) контактный номер телефона, с которого Вы звонили на горячую линию, дату и время звонка. Также просим прислать ссылку на Ваш отзыв, чтобы мы могли Вас идентифицировать. Мы обязательно выясним причины произошедшего и свяжемся с Вами.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-916- 52XXXXX

22.10.19 12:52:46

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

23.10.19 14:25:32

Добрый день!
Благодарим Вас за выбор лаборатории ИНВИТРО. Желаем здоровья Вам и Вашему ребенку.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-961- 29XXXXX

21.10.19 08:51:39

+2.0 Отлично пр. Ленина, д. 44/6 business

22.10.19 14:44:34

Ольга, добрый день!
Благодарим Вас за положительный отзыв. МЫ учтем Ваше замечание. Искренне желаем Вам здоровья!
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-977- 36XXXXX

16.10.19 12:26:14

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

18.10.19 16:06:05

Добрый день!
Благодарим Вас за доверие. Искренне желаем Вам здоровья!
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-928- 29XXXXX

25.09.19 08:39:32

-0.8 Плохо ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

26.09.19 16:31:49

Добрый день!
Мы очень сожалеем, что нашему специалисту не удалось взять у вас кровь. Напишите нам, пожалуйста, на почту Ваши ФИО, номер телефона, адрес офиса, дату и время посещения. Будем благодарны вам за обратную связь, так как для нас важно поддерживать качество на высоком уровне. Мы хотели бы разбраться, что привело к такому итогу и принять необходимые меры. Также просим прислать ссылку на Ваш отзыв, чтобы мы смогли Вас идентифицировать.
С уважением, команда ИНВИТРО

+7-977- 36XXXXX

03.09.19 12:11:07

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

04. 09.19 15:46:10

Добрый день!
Нам очень приятно, что Вы положительно оценили качество нашей работы. Желаем здоровья Вам и Вашим близким!
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-928- 75XXXXX

26.08.19 11:28:54

-2.0 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

27.08.19 14:45:21

Добрый день!
Большое спасибо за обратную связь. Приносим наши сожаления по поводу сложившейся ситуации.
Напишите, пожалуйста, нам на почту Ваши ФИО, номер телефона, с которого Вам звонили и на который звонили, приблизительное время звонка. Также пришлите ссылку на Ваш отзыв, чтобы мы могли Вас идентифицировать.
Мы хотим разобраться в ситуации и принять меры к виновным, так как для нас важно поддерживать качество на высоком уровне и заботиться о наших клиентах.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-928- 27XXXXX

19.08.19 09:08:41

-1.2 Ужасно пр. Космонавтов, д. 6/13 business

20.08.19 15:43:00

Добрый день!
Нам очень жаль, что произошла подобная ситуация, приносим извинения. Напишите, пожалуйста, нам на почту Ваши ФИО, номер телефона, с которого Вы звонили и на который звонили, чтобы сделать заказ, приблизительное время звонка. Также пришлите ссылку на Ваш отзыв, чтобы мы могли Вас идентифицировать. Мы обязательно все выясним и примем меры.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-928- 29XXXXX

18.07.19 15:06:35

-1.6 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

22.07.19 15:34:09

Добрый день!
Сожалеем, что Вам пришлось оказаться в такой ситуации.. Чтобы мы смогли провести проверку по Вашему отзыву, напишите, пожалуйста, нам на почту Ваши ФИО, ФИО ребенка, номер телефона, на который звонили и с которого звонили, дату звонка, ИНЗ (он указан на чеке), а также дату обращения в медицинский офис для взятия анализов ребенку. Мы обязательно разберемся в случившемся, чтобы впредь подобного не повторилось.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-999- 88XXXXX

04.07.19 13:38:04

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

12.07.19 16:51:29

Дарья, добрый день!
Нам очень приятно, что Вы положительно оценили качество нашей работы.
Мы действительно стараемся сделать наш сервис максимально комфортным для пациентов. Желаем Вам здоровья.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-919- 99XXXXX

25. 06.19 10:53:55

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

26.06.19 16:25:32

Добрый день!
Благодарим за Ваш отзыв. Искренне рады, что у Вас осталось положительное впечатление о нашей лаборатории.
Будем рады видеть Вас снова!
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-958- 24XXXXX

17.05.19 11:48:18

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

20.05.19 17:36:18

Добрый день!
Спасибо, что являетесь нашим клиентом. Будем рады видеть Вас снова!
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-906- 81XXXXX

23.04.19 15:08:00

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

24.04.19 13:37:42

Добрый день!
Мы очень рады, что у Вас осталось положительное впечатление о нашей лаборатории. Будьте здоровы.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-918- 85XXXXX

20.04.19 18:48:42

-1. 0 Плохо пр. Космонавтов, д. 6/13

22.04.19 16:09:45

Добрый день!
Нам жаль, что произошли такая ситуация, приносим свои искренние извинения. Напишите нам, пожалуйста, на почту Ваши ФИО и контактный номер телефона. Также пришлите ссылку на Ваш отзыв, чтобы мы могли Вас идентифицировать. Мы обязательно во всем разберемся и свяжемся с Вами.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-915- 21XXXXX

09.04.19 11:35:51

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

10.04.19 15:34:31

Добрый день!
Большое спасибо за Ваш отзыв. Нам очень приятно, что Вы так высоко оценили качество нашей работы. Желаем Вам здоровья!
С уважением, команда ИНВИТРО.

Михаил Н.

29.03.19 22:39:22

+2.0 Отлично ул. Рихарда Зорге, д. 52

01.04.19 15:44:30

Михаил, добрый день!
Спасибо за положительную оценку качества нашей работы. Желаем Вам здоровья.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-951- 83XXXXX

17.03.19 12:20:59

+2.0 Отлично ул. Рихарда Зорге, д. 52

18.03.19 16:46:13

Добрый день!
Спасибо за положительную оценку качества нашей работы. Желаем Вам здоровья.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-929- 68XXXXX

22.02.19 13:36:18

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

25.02.19 17:03:05

Добрый день!
Благодарим за то, что поделились своим мнением. Искренне рады, что у Вас сложилось положительное впечатление о нашей лаборатории. Желаем Вам здоровья
С уважением, команда ИНВИТРО.

Скрытый

10.02.19 16:22:40

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

11.02.19 16:27:20

Добрый день.
Спасибо, что являетесь нашим клиентом. Будем рады видеть Вас снова!
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-916- 22XXXXX

11.01.19 11:49:54

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

14.01.19 14:05:35

Добрый день!
Приятно знать, что обращение в Инвитро оставило положительное впечатление. Желаем Вам здоровья.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-915- 35XXXXX

25.12.18 12:04:01

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

26.12.18 16:43:56

Добрый день!
Благодарим за такие приятные слова в адрес нашей лаборатории. Будем рады видеть Вас снова.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-985- 73XXXXX

20.12.18 19:25:41

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

21.12.18 17:07:06

Добрый день!
Большое спасибо, что положительно оценили качество нашей работы. Будем рады видеть Вас снова!
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-928- 29XXXXX

17.11.18 19:14:58

-2.0 Ужасно ул. Станиславского, д. 54

20.11.18 16:27:51

Добрый день!
Сожалеем, что Вы оказались в такой ситуации, приносим извинения за доставленные неудобства. Напишите, нам ,пожалуйста, на почту Ваше ФИО, контактный номер телефона и время обращения в медофис. Мы обязательно проведем проверку по Вашему обращению и примем меры.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-988- 89XXXXX

17.10.18 20:31:35

-2.0 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

19.10.18 17:20:17

Добрый день!
Приносим свои искренние извинения за доставленные неудобства. На данный момент в связи с загрузкой лабораторий могут быть небольшие задержки в выдаче результатов, но они поступят в ближайшее время. Если результаты на данный момент Вам не поступили, сообщите, пожалуйста, Ваши ФИО, номер телефона и номер заказа, мы уточним информацию в лаборатории и свяжемся с Вами.С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-928- 15XXXXX

14.10.18 22:48:52

-2.0 Ужасно пр. Ленина, д. 44/6

01.11.18 17:04:38

Добрый день!
Сообщите, пожалуйста, Ваше ФИО, контактный номер телефона, с которого Вы звонили, номер телефона, на который Вы звонили, дату и примерное время звонка и адрес медицинского офиса ИНВИТРО, чтобы мы смогли детально разобраться в Вашей ситуации.
Можете направить эти данные на почту или оставить их в комментариях к отзыву.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-926- 26XXXXX

26. 09.18 11:30:53

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

27.09.18 16:49:46

Добрый день!
Спасибо, что выбрали нас. Мы учтем Ваше замечание. Будем рады видеть Вас снова.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-965- 22XXXXX

24.09.18 12:34:24

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

25.09.18 16:34:38

Добрый день!
Благодарим Вас за отзыв. Приятно знать, что Вы остались довольны качеством нашей работы. Желаем здоровья Вам и Вашим близким.
С уважением, команда ИНВИТРО.


Гость

25.07.18 15:15:34

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

27.07.18 10:59:34

Добрый день!
Большое спасибо, что положительно оценили качество нашей работы. Будем рады видеть Вас снова!
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-988- 99XXXXX

11.07.18 08:17:40

-2.0 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

12.07.18 17:29:27

Добрый день!
Сожалеем, что Вы оказались в подобной ситуации. Для того, чтобы мы смогли провести проверку по Вашему отзыву, уточните, пожалуйста, Ваши ФИО, номер заказа, контактный номер телефона, а также адрес медицинского офиса, в который Вы обращались. Мы обязательно разберемся в случившемся и оповестим Вас.
С уважением, команда ИНВИТРО


Гость

25.06.18 22:42:39

-2.0 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

26.06.18 14:45:45

Добрый день!
Нам жаль, что обращение в ИНВИТРО не оставило положительного впечатления.
Сообщите, пожалуйста, Ваши ФИО, контактный номер телефона, номер заказа услуги ИНВИТРО и дату обращения, чтобы мы смогли детально разобраться в Вашей ситуации.
Можете направить эти данные на почту или оставить их в комментариях к отзыву.
С уважением, команда ИНВИТРО

+7-952- 56XXXXX

06.06.18 10:34:11

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

07.06.18 12:48:39

Добрый день!
Благодарим Вас за то, что выбираете ИНВИТРО!
Мы и впредь будем стараться оправдывать Ваше доверие.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-960- 46XXXXX

09.05.18 17:02:34

-1.0 Плохо ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

14.05.18 11:46:20

Добрый день!
Нам жаль, что обращение в ИНВИТРО не оставило положительного впечатления.
Сообщите, пожалуйста, Ваши ФИО, контактный номер телефона, номер заказа и дату обращения, чтобы мы смогли детально разобраться в Вашей ситуации.
Можете направить эти данные на почту или оставить их в комментариях к отзыву.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-988- 55XXXXX

30.04.18 16:16:57

+1.0 Хорошо ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

04.05.18 13:46:31

Добрый день!
Спасибо, что поделились мнением о нашей компании!
Наши цены обусловлены высокими требованиями к организации всех этапов лабораторного процесса: взятия, подготовки и кратковременного хранения биоматериала в медицинском офисе, транспортировки его в лабораторию, непосредственно выполнения анализа, выдачи результата.
В ИНВИТРО действует демократичная ценовая политика и применяются высокие стандарты эффективного обслуживания пациентов. Мы стремимся учитывать финансовые возможности всех слоев населения, поэтому во всем медофисах у нас действует дисконтная программа. Для пациентов мы регулярно проводим акции, информацию о которых всегда можно найти на сайте:
Срок исполнения указан на Вашем чеке, если он превышен, то Вы можете написать нам на почту , мы обязательно во всем разберемся
С уважением, команда ИНВИТРО.


Гость

17.03.18 20:20:09

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

19.03.18 12:16:13

Добрый день!
Спасибо, что поделились впечатлениями о нашей компании.
Будьте здоровы!
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-928- 77XXXXX

01.03.18 12:09:23

-1.2 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А business

07.03.18 16:20:00

Добрый день!
Нам жаль, что обращение в ИНВИТРО не оставило положительного впечатления.
Сообщите, пожалуйста, Ваше ФИО, контактный номер телефона, номер заказа, адрес медицинского офиса, в котором Вы получили услуги ИНВИТРО, и дату обращения, чтобы мы смогли детально разобраться в Вашей ситуации.
Можете направить эти данные на почту или оставить их в комментариях к отзыву.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-960- 45XXXXX

20.02.18 13:57:06

-2.0 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

21.02.18 19:13:18

Добрый день!
Срок исполнения указан на Вашем чеке, если он превышен, то Вы можете написать нам на почту , мы обязательно во всем разберемся
С уважением, команда ИНВИТРО.


Гость

05.02.18 10:15:16

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

21.02.18 11:39:50

Добрый день!
Спасибо, что поделились впечатлениями о нашей компании.
Будьте здоровы!
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-903- 40XXXXX

03.02.18 22:24:37

-2.0 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

21.02.18 19:14:24

Здравствуйте!
Нам жаль, что обращение в ИНВИТРО не оставило положительного впечатления. Если у Вас есть замечания по работе компании ИНВИТРО, напишите нам, пожалуйста, на почту Для нас важно поддерживать качество на высоком уровне, и мы будем рады вашему отзыву, чтобы стать лучше
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-951- 53XXXXX

14.01.18 02:54:45

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

21.02.18 11:42:39

Добрый день!
Нам очень приятно, что Вы положительно оценили качество нашей работы.
Мы действительно стараемся сделать наш сервис максимально комфортным для пациентов.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-928- 77XXXXX

30.11.17 08:59:11

-2.0 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

21.02.18 19:15:24

Добрый день!
Нам жаль, что обращение в ИНВИТРО не оставило положительного впечатления.
Сообщите, пожалуйста, Ваше ФИО, контактный номер телефона, номер заказа, адрес медицинского офиса, в котором Вы получили услуги ИНВИТРО, и дату обращения, чтобы мы смогли детально разобраться в Вашей ситуации.
Можете направить эти данные на почту или оставить их в комментариях к отзыву.
С уважением, команда ИНВИТРО.


Гость

17.07.17 14:10:09

-1.0 Плохо ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

05.09.17 12:20:11

Добрый день!
Нам жаль, что обращение в ИНВИТРО не оставило положительного впечатления.
Сообщите, пожалуйста, номер телефона, с которого Вы звонили и на какой номер звонили, номер заказа, чтобы мы смогли детально разобраться в Вашей ситуации.
Можете направить эти данные на почту или оставить их в комментариях к отзыву.
С уважением, команда ИНВИТРО

+7-951- 51XXXXX

30.06.17 09:27:03

-2.0 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А

06.09.17 10:17:09

Добрый день!
Нам жаль, что сложилась такая ситуация.
Сообщите, пожалуйста, номер, с которого Вы звонили на какой звонили, дату звонка, а также адрес медицинского офиса, в который Вы хотели обратиться, чтобы мы смогли детально разобраться в Вашей ситуации.
Можете направить эти данные на почту или оставить их в комментариях к отзыву.
С уважением, команда ИНВИТРО.

+7-988- 99XXXXX

04.03.17 23:48:09

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А


Гость

17.10.16 16:01:33

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А


Гость

12.07.16 09:13:47

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А


Гость

21.06.16 17:28:12

+2.0 Отлично ул. Ленина, д. 81


Гость

21.03.16 20:29:35

-2.0 Ужасно ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А


Гость

26.10.15 13:25:35

+2.0 Отлично ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А


Гость

19.05.15 11:50:18

-1.0 Плохо ул. 1-й Конной Армии, д. 29-А


Гость

22.03.15 23:03:03

+2.0 Отлично ул. Ленина, д. 81

На какие акции положительно повлияла эпидемия коронавируса

Фондовые индексы США и Европы упали с максимума 19 февраля на 12–15%, сильно просели многие азиатские рынки, а также российский, из-за опасений, что распространяющаяся по миру пандемия коронавируса подорвет экономику, бизнес и прибыли компаний. Но на общем темном фоне есть и светлые пятна. Инвесторы вкладываются в бумаги организаций из сферы здравоохранения, а также в акции компаний, которые выиграют, если тысячи или даже миллионы людей окажутся на карантине в своих домах.

Как ни удивительно, хорошо себя чувствует и фондовый рынок страны, в которой началась вспышка коронавируса, – Китая. Индекс CSI 300, в который входят акции ведущих компаний с Шанхайской и Шэньчжэньской бирж, сейчас выше уровня, на котором он находился перед новогодними каникулами (по лунному календарю), с которых миллионы китайцев не вернулись на работу.

Запастись едой и салфетками

Акции Campbell Soup 4 марта подорожали на 10%, это их самый сильный дневной рост за последние два десятилетия, отмечает Financial Times. В последующие два дня акции немного снизились с достигнутого уровня, хотя индекс S&P 500 упал на 5%. С 19 февраля акции Campbell Soup выросли на 8,4%, в то время как S&P 500 потерял более 12%. За это же время акции американской сети магазинов у дома Kroger подорожали на 8,5%, акции производителя дезинфицирующих салфеток Clorox – на 5,2%, а разработчика видеоигр Electronic Arts и видеосервиса Netflix снизились на 2–4%, что тоже можно считать достижением на фоне обвала рынка. Акции Kimberly-Clark, выпускающей, в частности, одежду для медперсонала и гигиенические материалы, в феврале упали со всем рынком, но в марте взлетели до нового исторического максимума.

Все эти бумаги участвуют в «коронаторговле», говорит главный стратег по рынкам Leuthold Group Джим Полсен (его слова приводит FT): люди закупаются продуктами и видеоиграми на случай, если им придется сидеть дома. Из-за коронавируса выросла вероятность того, что «потребители будут запасаться супом и есть дома чаще, чем обычно», написали в отчете аналитики JPMorgan Chase.

Запастись золотом

После первоначальной нервной реакции стали быстро восстанавливаться акции золотодобывающих компаний. Нет никаких причин для падения цен на золото, учитывая не только его статус безопасного актива, но также смягчение денежной и бюджетной политики по всему миру, которое еще больше увеличивает ликвидность и ведет к конкурирующей девальвации валют, считает Йон Триси, издатель инвестиционного бюллетеня Fuller Treacy Money.

В конце февраля цена золота и вслед за ним акции золотодобывающих компаний резко подешевели. Продавая их, инвесторы затыкали дыры в своих портфелях, образовавшиеся в результате обвала на фондовом рынке, объясняет Триси. На этой неделе золото не только отыграло все потери, но и вырастало в цене до $1690 за тройскую унцию (на закрытии в пятницу – $1673,8 против $1611,7 за унцию 19 февраля). А биржевой фонд акций золотодобывающих компаний VanEck Vectors Gold Miners нивелировал бóльшую часть падения февраля.

Запастись лекарствами

В выигрыше также оказались акции биотехнологических и фармацевтических компаний, прежде всего тех, что смогут предоставить вакцину или лекарства для борьбы с коронавирусом. Котировки Inovio Pharmaceuticals подскочили после того, когда она сообщила 3 марта, что ускоряет разработку вакцины от коронавируса и рассчитывает в апреле начать клинические тесты в США. В тот день ее акции подорожали сразу на 70%, 4 марта – еще на 7,8%, а 5 марта – на 22,1%. Всего за последние три месяца ее акции выросли в три с лишним раза.

Inovio специализируется на разработке вакцин с учетом ДНК. Как рассказал ее гендиректор Джозеф Ким на встрече с представителями администрации президента США, компания начала работу над вакциной 10 января, спустя три часа после публикации генетического кода вируса. К концу года Inovio планирует поставить 1 млн доз вакцины, но для увеличения объемов производства ей потребуется дополнительное финансирование, пишет MarketWatch.

Покупали инвесторы и акции Gilead Sciences, чье экспериментальное лекарство ремдезивир, как сообщил 25 февраля Национальный институт здравоохранения США, первым начало тестироваться на предмет борьбы с коронавирусом. Акции Gilead росли с середины января, подорожав на 28,1%. В пятницу они прибавили 5,4%, а отраслевой индекс акций медицинских и биотехнологических компаний Health Care/Life Sciences – 4,3%, тогда как S&P 500 потерял 1,7%.

Присмотреться к Китаю

Лучше всех с начала февраля показал себя китайский рынок. Открывшись 3 февраля после новогодних каникул падением на 9%, индекс CSI 300 с тех пор вырос на 13,7%. 5 февраля он даже закрывался на самом высоком уровне с начала 2018 г.

Темпы роста числа заразившихся коронавирусом падают в Китае с начала февраля. Уровень смертности, согласно последней статистике, снизился до 1% против 3–4% в разгар эпидемии в стране и за пределами Китая сейчас, указывает Йон Триси. Поддержку фондовому рынку, по его словам, также оказывают стимулирующие меры властей, такие как запрет на банкротства, продление сроков обращения облигаций и избыточная ликвидность. Вряд ли рынок продолжит активно расти, учитывая неопределенность ситуации в мире, «но он, без сомнения, демонстрирует относительную силу», говорит Триси. Вероятно, международные инвесторы также поддержали рост китайских акций, надеясь, что первым оказавшись в кризисе, Китай первым из него и выйдет, полагает он.

«Инвитро»: купоны, скидки и акции за март – апрель 2021

Сеть независимых лабораторий «Инвитро» специализируется на проведении анализов и функциональной диагностики. Высокая точность результатов, современное оснащение всех филиалов компании, наличие лицензий на осуществление медицинской деятельности – причины, по которым многие люди доверяют именно этому бренду.

Постоянные клиенты компании участвуют в бонусной программе лояльности, кроме того, получить скидки на услуги Invitro можно по нашим промокодам. На официальном сайте компании предусмотрена возможность быстрой онлайн-записи на любые анализы.

Мнения клиентов о лабораторных центрах «Инвитро»

Какие отзывы о посещении лабораторий Invitro оставляют реальные люди? Клиенты чаще всего отмечают следующие особенности и преимущества компании:

  • Большой выбор услуг и максимальная достоверность результатов. Лаборатории сети не ограничиваются биохимическими, аллергологическими, гематологическими исследованиями. В филиалах компании можно сделать рентген, колоноскопию, томографию, определить наследственную предрасположенность к различным заболеваниям. Результаты исследований признаются во всех медицинских учреждениях страны. Нет возможности самостоятельно приехать в клинику? Закажите выполнение анализов на дому.
  • Доступность услуг для каждого клиента. Для того чтобы пройти обследование, необязательно иметь на руках направление своего лечащего врача. После проведения анализов в «Инвитро» человек получает результаты с подробной инструкцией для их интерпретации.
  • Максимально комфортный и быстрый сервис. При заказе услуг на официальном сайте Invitro вы можете выбрать ближайший филиал и максимально удобное время посещения центра. Многие клиенты компании акцентируют внимание на том, что в лабораториях никогда нет больших очередей даже в том случае, если человек не записывался заранее. Результаты большей части исследований можно получить в день обращения, кроме того, компания предлагает возможность срочного выполнения анализов (за отдельную плату).
  • Внимательное отношение к посетителю. В своих отзывах клиенты часто рассказывают о том, что взятие биологического материала в Invitro происходит безболезненно. Медицинский персонал обучен работе даже с самыми маленькими пациентами.

Решили записаться на обследование? Клиенты «Инвитро» рекомендуют заранее ознакомиться с инструкцией по подготовке к анализам: вся необходимая информация есть на сайте компании. Специалисты лабораторных центров строго соблюдают требования безопасности: используют одноразовые инструменты и стерильные перчатки. Важный момент! После взятия биоматериала медики клеят на пробирку уникальный стикер с ФИО в присутствии пациента.

Прямо сейчас вы можете ознакомиться с актуальной информацией о текущих акциях лабораторных центров. На этой странице мы также предлагаем вашему вниманию действующие купоны на скидку «Инвитро». Позаботьтесь о своем здоровье уже сегодня!

Москвичи и петербуржцы из групп риска смогут пройти бесплатное обследование на рак печени

В течение осени жители Москвы и Санкт-Петербурга из групп риска смогут пройти бесплатное медицинское обследование на выявление рака печени. Акция проводится при поддержке компании «Рош» на базе медицинских офисов «Инвитро» в рамках месяца повышения осведомленности о раке печени.  

Обследование включает ультразвуковую диагностику (УЗИ) печени и анализ крови на АФП (альфа-фетопротеин) и доступно при наличии квот (их количество ограничено). Пройти тест на принадлежность к группе риска по раку печени, заполнить заявку на обследование, а также узнать подробную информацию об акции можно на сайте liverlive.ru.

Печень — это жизненно важный орган, который участвует в метаболизме почти всех классов веществ. Из-за отсутствия нервных окончаний в печеночной ткани повреждения печени никак себя не проявляют вплоть до самых запущенных стадий, когда уже нарушены ее основные функции или повреждены соседние органы. Это относится и к злокачественным новообразованиям печени.

 

Валерий Владимирович Бредер, д.м.н, врач онколог, ведущий научный сотрудник ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России: «Основные группы риска по раку печени — это те группы, где вероятность развития рака печени выше, чем у здоровых людей. В большинстве случаев — это цирроз печени любой причины, и не всегда алкогольный. Причем, чем дольше человек страдает циррозом, тем выше вероятность развития заболевания. Вирусные гепатиты сами по себе являются факторами риска. У инфицированных гепатитом В или С рак печени может развиваться и без цирроза, также опасны ожирение и сахарный диабет. Чем более неумеренное употребление еды, тем больше дисбаланс обмена веществ в организме. И это большая проблема, которая с годами приводит к серьезным нарушениям функций печени и ее повреждениям. Ну а курение — универсальный фактор риска для развития любого онкологического заболевания» [1].  

Рак печени — тяжелое заболевание, занимающее четвертое место по смертности среди онкологических заболеваний в мире [2]. Самый распространенный вид рака печени — гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) [3]. Более 65% пациентов с ГЦК умирают в течение одного года с момента установления диагноза. Это обусловлено тем, что 60% случаев злокачественных новообразований печени и внутрипеченочных протоков в России приходятся на IV стадию [4].

 

Яна Новикова, директор по клиническим исследованиям группы компаний «Инвитро»: «Как и многие другие заболевания, рак печени лучше всего поддается лечению на раннем этапе. К сожалению, пациенты могут упустить это время из-за отсутствия симптомов, поэтому так важно проходить скрининговые обследования. Мы надеемся, что наш совместный проект с компанией “Рош” мотивирует пациентов внимательно относиться к своему здоровью».

 

Екатерина Фадеева, медицинский директор компании «Рош»: «Возможности онкологии сегодня значительно расширяются, появляются новые методы лечения, которые помогают пациенту бороться со злокачественным новообразованием даже на поздних стадиях, когда болезнь метастазировала. При этом каждый случай заболевания уникален, и чем раньше выявлен патологический процесс, тем больше шансов на успешное излечение. Мы надеемся, что наше партнерство с компанией “Инвитро” поможет обратить внимание пациентов из групп риска на важность своевременного обращения к врачу».

 

О компании «Инвитро»
«Инвитро» — одна из ведущих частных медицинских компаний, специализирующаяся на лабораторной диагностике и медицинской помощи, основана в 1995 году. Международный уровень качества, исключительный сервис и высокотехнологичные инновационные решения — главные приоритеты работы «Инвитро». Компания располагает крупнейшей в Восточной Европе сетью медицинских офисов (около 1 500) в 6 странах и 8-ю самыми современными лабораторными комплексами, которые ежегодно выполняют более 76 000 000 исследований. Компания имеет собственное подразделение, проводящее все фазы клинических исследований по любым направлениям, включая исследования медицинских препаратов и изделий in vitro по стандартам OEAS. В группу компаний «Инвитро» входят диагностические центры, собственные медицинские клиники, Высшая медицинская школа, а также компания Vet Union, предоставляющая лабораторные услуги в ветеринарии. Основатели «Инвитро» — инвесторы российской лаборатории инновационных биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions.

 

О компании «Рош»
«Рош» (Базель, Швейцария) — глобальная инновационная компания в области фармацевтики и диагностики, которая использует передовую науку, чтобы улучшить жизни людей. В 2019 году инвестиции компании в исследования и разработки составили 11,7 млрд швейцарских франков. «Рош» является одним из крупнейших разработчиков и производителей биотехнологических лекарственных препаратов для лечения онкологических, аутоиммунных, инфекционных и неврологических заболеваний. Компания также является одним из лидеров в области диагностики in vitro и гистологической диагностики онкологических заболеваний, а также пионером в области самоконтроля сахарного диабета. Объединение фармацевтического и диагностического подразделений позволяет «Рош» быть одним из лидеров в области персонализированной медицины. АО «Рош-Москва» представляет в России фармацевтическое подразделение компании. Работая со всеми заинтересованными сторонами, мы стремимся улучшить доступ российских пациентов к инновационным технологиям в лечении заболеваний. 27 препаратов компании входят в перечень ЖНВЛП. «Рош» вносит долгосрочный вклад в развитие медицины, науки, общественного здравоохранения и фармацевтической промышленности в России. Подробнее на www.roche.ru.

Все товарные знаки, используемые или упомянутые в этом сообщении, защищены законом.

НИЧТО В ДАННОМ МАТЕРИАЛЕ, ВКЛЮЧАЯ РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОХОЖДЕНИЯ ОНЛАЙН-ТЕСТА НА ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ К ГРУППЕ РИСКА, НЕ ДОЛЖНО ВОСПРИНИМАТЬСЯ КАК ЗАМЕНА КОНСУЛЬТАЦИИ ВАШЕГО ЛЕЧАЩЕГО ВРАЧА. КОМПАНИЯ «РОШ» НЕ НЕСЕТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ЗА ЧАСТИЧНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ И/ИЛИ ПЕРЕРАБОТКУ ДАННОГО МАТЕРИАЛА.

 

Ccылки
[1] Мнение автора может не совпадать с позицией компании «Рош».
[2] WHO. International Agency for Research on Cancer. Estimated age-standardized mortality rates (World) in 2018, worldwide, both sexes, all ages. Доступ: https://gco.iarc.fr/today/online-analysis-multi-bars?v=2018.
[3] Llovet et al. Nat Rev Dis Primers 2016.
[4] Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахзадовой. Состояние онкологической помощи населению России в 2019 году. − М.: МНИОИ им. П.А. Герцена − филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2020. − илл. – 239 с.

 

Контакты для СМИ
Рош: +7 495 229 29 99 / [email protected]
Инвитро: +7 (495) 258 07 88, доб. 81021 / [email protected]

Медицинская компания «ИНВИТРО» открыла новый офис в Екатеринбурге на проспекте Академика Сахарова

Новый медицинский офис «ИНВИТРО» на пр. Академика Сахарова, 51 предлагает пациентам более 2000 видов лабораторных исследований, взятие урологического и гинекологического материала, а также возможность пройти ЭКГ, УЗИ, гинеколога. Обратиться в новый медицинский офис можно самостоятельно или по направлению лечащего врача.

 

 

Результаты исследований соответствуют государственному стандарту и принимаются в любой поликлинике.

Одноразовые вакуумные системы делают процедуру взятия биоматериала быстрой, безопасной и практически безболезненной. Каждый образец маркируется уникальным штрих-кодом, что обеспечивает его идентификацию и исключает возможность перепутать образцы. Перед отправкой пациенту результаты проходят двойное подтверждение – медицинское и технологическое.

 

Вы можете оперативно узнать о готовности результатов исследований с помощью бесплатного SMS-уведомления. А получить их — по электронной почте, через личный кабинет на сайте www.invitro.ru, по телефону, назвав кодовое слово, или обратившись в медицинский офис. Персональные данные пациентов строго конфиденциальны.

 

ВЫБРАНА

ВЫБРАНА

ВЫБРАНА

 

В честь открытия действует акция — «Скидка 20 % на все лабораторные исследования»*, период действия с 04.07.2020 до 31.08.2020 года.

 


 

Медицинский офис «ИНВИТРО»

 

пр. Академика Сахарова, 51

+7 (343) 222-03-60

 


 

*Лицензия №ЛО-66-01-006552 от 02.07.2020. Товарный знак по сублицензии. Акция действует только в медицинском офисе ИНВИТРО по адресу: г. Екатеринбург, ул. Ак.Сахарова. 51. Скидка распространяется на услуги лабораторной диагностики, действуют ограничения; список ограничений уточняйте по телефону 8 (343) 222-03-60. Скидка не распространяется на услуги взятия биоматериала, исследования почвы и воды, генетические исследования и тесты №1303HEL, № 153, № 1526, № 20. Стоимость исследования по прайсу, а также подробная информация об организаторе акции, правилах и порядке ее проведения, количестве призов, сроках, месте и порядке их получения доступна на сайте invitro.ru и по телефону 8 (343) 222-03-60.

 

ИМЕЮТСЯ ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ. ТРЕБУЕТСЯ КОНСУЛЬТАЦИЯ СПЕЦИАЛИСТА.

Во Владикавказе стартовала благотворительная акция «Рука помощи»

Во Владикавказе стартовала благотворительная акция “Рука помощи”

Дзæуджыхъæуы йæ куыст кæнын райдыдта хæрзаудæн акци «Рука помощи»

Во Владикавказе стартовала благотворительная акция «Рука помощи». Для жителей владикавказских соцприютов ее организовал фонд «Быть добру». По словам учредителя фонда Амурхана Кусова, подопечным соцприютов необходимы матрасы и одеяла, одежда и средства гигиены.

«В соцприюте находятся люди без определенного места жительства, люди, которые, к сожалению, оказались на улице. Большое счастье, что они обрели там свое пристанище. У них хорошие условия, отличное питание и уход. Сотрудники приюта также восстанавливают им документы. Но им нужна дополнительная помощь. Это малоимущие люди, которые не могут позволить себе купить сменную одежду и другое», — сказал Кусов.

Подобная акция проходит впервые, однако руководители фонда планируют проводить ее и в дальнейшем  — несколько раз в году. В течение месяца любой желающий может принести одежду или средства гигиены в социальные приюты, расположенные на ул. Тельмана, 33, Морозова, 43 и Ушакова, 2.

Карина 15-Хадаева

Дзæуджыхъæуы йæ куыст кæнын райдыдта хæрзаудæн акци «Рука помощи». Дзæуджыхъæуккаг социалон фысымуæтты уæвæг адæмæн æй бацæттæ кодта фонд «Быть добру». Фонды бындурæвæрæг Хъуысаты Амурханы ныхæстæм гæсгæ, социалон фысымуæтты æвджид уæвæг адæмы хъæуы гобæттæ æмæ хъæццултæ, уæлæдарæс æмæ химæ зилыны фæрæзтæ.

«Социалон фысымуæтты уæвæг адæмæн бæлвырд цæрæн бынат нæй, уыцы адæм, хъыгагæн, уынджы къæйыл аззадысты. Сæ амондæн уым фысымуат ссардтой. Хорз уавæртæ сын ис, иттæг хорз хæлц æмæ æркаст. Фысымуаты кусджытæ сын сæ гæххæттытæ дæр ног кæнынц. Фæлæ сæ, хъыгагæн, уæлæмхасæн æххуыс хъæуы. Цыбыркъух адæм сты, æмæ сæхицæн ивæн дарæс æмæ æндæр хъæугæ дзауматæ балхæнын сæ къух нæ амоны», – загъта Хъуысаты Амурхан.

Ахæм хуызы акци фыццаг хатт арæзт цæуы, фæлæ йæ фонды разамонджыты фæндмæ гæсгæ дарддæр дæр кæндзысты – афæдз цалдæр хатты. Иу мæйы æмгъуыдмæ, кæй фæнды, уыдоны бон у социалон фысымуæттæм уæлæдарæс кæнæ химæ зилыны фæрæзтæ æрбахæссын, уыдон сты Тельманы уынджы 33 хæдзары, П. Морозовы уынджы 43 хæдзары æмæ Ушаковы уынджы 2 хæдзары.

Каринæ 15-Хадаты

Белки сыворотки могут облегчить идентификацию болезни Кавасаки и способствовать инфильтрации нейтрофилов in vitro

Вопрос регистрации субъектов и этики

Мы зарегистрировали китайских субъектов хань в отделении педиатрии больницы общего профиля для ветеранов Гаосюна (KVGH), Тайвань. Это исследование было одобрено институциональным советом по этике KVGH (номер одобрения IRB VGHKS19-CT2-22). Все субъекты или их опекуны подписали форму информированного согласия. Все протоколы были выполнены в соответствии с соответствующими инструкциями и правилами.Всего в этом исследовании приняли участие 37 здоровых людей из контрольной группы (HC, без лихорадки), 38 человек из контрольной группы (FC, с лихорадкой, но не диагностированной как KD) и 93 объекта KD. Мы набрали здоровых детей контрольной группы из нашего обычного отделения. Эти дети прошли медицинское обследование и взяли кровь для лабораторных исследований, таких как общий анализ крови, биохимия сыворотки и т. Д. Остальные образцы крови были использованы для этого исследования с одобрения их опекунов. Мы включили в исследование детей, контролирующих лихорадку, с лихорадкой (температура тела ≥ 38 ° C) в течение не менее 3 дней и с очевидными диагностированными инфекциями дыхательных путей, включая острый фарингит, острый бронхит, острый тонзиллит и острую бронхопневмонию.Кроме того, используя анкету и ссылаясь на медицинские записи, мы исключили субъектов HC и FC с историей болезни KD, аутоиммунным заболеванием, аллергическим заболеванием или сердечно-сосудистым заболеванием.

В этом исследовании не участвовали пациенты с атипичными КД. Всем детям с КД была проведена двумерная эхокардиография во время постановки диагноза и снова через две, четыре, восемь и 12 недель и шесть месяцев после лечения, а также ежегодно при последующем наблюдении. Среди пациентов с KD у 16 ​​пациентов были CAL, а у 14 не было ответа на IVIG.Чтобы избежать шума от лекарств, мы исключили пациентов, принимающих стероиды. У всех субъектов HC и FC забор крови проводился только один раз. У большинства субъектов с KD кровь брали три раза, а именно перед введением IVIG, через три дня после введения IVIG и через три недели после введения IVIG.

Сбор крови

При каждом анализе крови все субъекты сдавали две пробирки с кровью (3 мл на пробирку), одна из которых предназначалась для сбора сыворотки, а другая — для сбора общего количества лейкоцитов (WBC) с помощью красных кровяных телец. (RBC) лизис.Собранные образцы сыворотки хранили при -80 ° C. Мы использовали набор для выделения miRNA mirVana (Ambion, CA, USA) для извлечения РНК из общего количества лейкоцитов в соответствии с протоколами производителя.

Гелевая протеомика iTRAQ для глобального скрининга сывороточных белков

Для глобального скрининга сывороточных белков мы случайным образом отобрали 12 подходящих по возрасту и полу образцов сыворотки FC и 12 KD. Отобранные образцы сыворотки были сначала подвергнуты истощению с высоким содержанием белка с помощью спин-колонок Pierce Top 12 Abundant Protein Depletion (85165, Thermo).Затем образцы сыворотки шести субъектов были равномерно объединены, в результате чего были получены два объединенных образца FC и два объединенных образца KD. Затем четыре объединенных образца сыворотки были подвергнуты пробоподготовке с помощью набора iTRAQ Reagents Multiplex Kit (4352135, Sciex). После прохождения стандартной проверки QC меченые образцы сыворотки анализировали с помощью LC / Q-Exactive Orbitrap MS (Thermo) в течение 24 часов, а полученные необработанные данные анализировали с помощью Proteome Discoverer v2.4 (Thermo), обращаясь к базе данных MASCOT 2.5. (Матричная наука).В результате мы получили относительные количества обнаруженных белков.

ELISA для специфического измерения концентраций белков сыворотки

Среди белков, обнаруженных с помощью iTRAQ, мы выбрали шесть для ELISA во всех образцах сыворотки. Белки S100A были выбраны из-за их роли в инфильтрации нейтрофилов в нашем предыдущем исследовании 22 . PRDX2, ORM1 и DEFA1 были выбраны потому, что их вариации были согласованы между двумя образцами FC и двумя образцами KD. Кроме того, данные три белка были связаны с окислительным стрессом, воспалением или инфекцией, согласно результатам поиска в литературе.Мы использовали ELISA для определения абсолютных концентраций сывороточных белков, следуя инструкциям производителей наборов для ELISA. Наборы ELISA следующие: S100A8 (CY-8061, MBL, Япония), S100A9 (CY-8062, MBL, Япония), S100A12 (CY-8058V2, MBL, Япония), DEFA1 (ARG82004, Arigo, Тайвань), ORM1. (EG5001-1, AssayPro, США) и PRDX2 (KA4801, Абнова, Тайвань).

Анализ метилирования промотора и анализ кПЦР

Мы провели анализ метилирования промотора, имитируя предыдущее исследование 23 .Предполагаемую промоторную область гена S100A12 амплифицировали с помощью ПЦР с последующим перевариванием рестрикционным ферментом HindIII и клонированием в вектор экспрессии люциферазы pGL4.21 (Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Затем вектор подвергали метилированию in vitro с использованием фермента метилтрансферазы M. SssI (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). M. SssI распознает паттерн последовательности CpG и катализирует метилирование цитозина in vitro по распознанному паттерну последовательности. Затем проводили анализ люциферазы в Т-клетке 293 с использованием набора системы анализа репортерной люциферазы Dual-Glo (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) через 24 часа после трансфекции.Для анализов кПЦР последовательности праймеров ПЦР следующие: S100A12: прямой праймер (5′-CTTACAAAGGAGCTTGCAAAC-3 ‘) и обратный праймер (5′-GGTGTGGTAATGGGCAG-3′). 18S: прямой праймер (5’-GTAACCCGTTGAACCCCATT -3 ‘) и обратный праймер (5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG -3’).

Клеточная культура, выделение и лечение

В этом исследовании мы культивировали одну линию лейкоцитов (HL-60), одну первичную культуру эндотелиальных клеток коронарных артерий человека (HCAEC) и один свежевыделенный нейтрофил.HL-60 (№ 60027, BCRC, Тайвань) был дифференцирован как нейтрофилоподобные клетки путем индукции 1,3% ДМСО (Sigma-Aldrich, Миссури, США). HL-60 и HCAEC (CC-2585, Lonza, Switzerland) культивировали и поддерживали, как было предложено в предыдущем исследовании 22 . Свежевыделенные нейтрофилы собирали из общей крови здорового взрослого субъекта с использованием Dynabeads CD15 (11137D, Invitrogen), как это рекомендовано производителем. В этом исследовании нейтрофилы и HCAEC обрабатывались 20% сывороткой, IVIG (3740501374, TBSF), рекомбинантным белком S100A12 (1052-ER-050, R&D), антителом против S100A12 (PA5-76712, Invitrogen) и / или контрольным IgG ( UB276978, eBioscience).Дозировка ВВИГ в культуральной среде составляет 10 мг / мл, как было предложено в предыдущем исследовании 24 . Все введенные дозы S100A12, антитела и контроля IgG составляли 152 нг / мл, примерно 20% от среднего значения концентраций S100A12 в сыворотке у субъектов с KD (757,9 нг / мл, таблица 3).

Определение интенсивности молекул поверхностной адгезии

Нейтрофилы, обработанные сывороткой или S100A12 в течение 24 часов, собирали и промывали PBS. Затем их окрашивали следующими антителами проточной цитометрии: CD11a-FITC (для ITGAL, 565280, BD), CD11b-FITC (для ITGAM, 563088, BD), CD18-FITC (для ITGB2, 743370, BD), CD29- FITC (для ITGB1, 746022, BD), CD49d-FITC (для ITGA4, 559,881, BD) или CD184-FITC (для CXCR4, 555974, BD).Затем они были количественно определены и проанализированы с помощью проточного цитометра LSRII (BD Biosciences). Мы использовали геометрические величины, чтобы представить интенсивности молекул удельной поверхностной адгезии.

Анализ миграции лейкоцитов через эндотелий хвост (LTEM)

Мы использовали анализ LTEM для оценки инфильтрационной способности нейтрофилов, ссылаясь на предыдущее исследование 22 . Для этой цели мы подготовили анализ LTEM путем посева 2 × 10 5 HCAEC в покрытые желатином вставки для подвешивания (также называемые верхней камерой, Merck, NJ, USA) на 24 часа.Кроме того, мы обрабатывали нейтрофилы (линия клеток HL-60, индуцированная ДМСО) сывороткой, IVIG, рекомбинантным белком S100A12, антителом против S100A12 и / или контрольным IgG в течение 24 часов. Для хрупких свежевыделенных нейтрофилов применялась только четырехчасовая обработка.

В день анализа миграции обработанные нейтрофилы собирали промыванием бессывороточной среды. Затем 1 × 10 5 нейтрофилов помещали во вставки, и вставки далее перемещали в 24-луночные культуральные планшеты (также называемые нижней камерой), которые содержали 600 мкл среды с 200 нМ fMLP (Sigma-Aldrich, MO, США) в качестве химиоаттрактанта.После двухчасовой миграции собирали нейтрофилы, проникающие через эндотелиальный слой и мигрирующие в нижнюю камеру. Затем собранные клетки промывали PBS и окрашивали CD15-FITC (340703, BD) с последующим количественным определением и анализом с помощью проточного цитометра LSRII (BD Biosciences).

Заявление об этике

Это исследование было одобрено институциональным советом по этике KVGH с номером одобрения IRB VGHKS19-CT2-22. Все субъекты или их опекуны подписали форму информированного согласия.

Оценка свойств стимуляции роста растений и индукции механизма антиоксидантной защиты ризобактериями чая из Дарджилинга, Индия

Выделение и идентификация ризобактерий из ризосферы чая

Почвенные микроорганизмы играют решающую роль в здоровье и развитии растений. Более того, они вносят огромный вклад в сельскохозяйственное производство различных культур. В районе Дарджилинг чай выращивается как основная товарная культура. Помимо чая, выращивается ряд других культур, таких как рис, кукуруза, пшеница, горчица, просо, имбирь, апельсин, крупный кардамон и овощные культуры. 19 (Источник: https: // darjeeling.gov.in/agriculture.html). Рис и кукуруза — самые важные продовольственные зерновые культуры, выращиваемые в этом регионе. Однако из-за кислой природы почвы в этом регионе выращивание сельскохозяйственных культур становится все труднее. Агрохимикаты, в том числе азотные удобрения, еще больше усложняют ситуацию, поскольку они еще больше способствуют подкислению почвы. В слабокислых почвах района Дарджилинг (4,2 22 .Предыдущие исследования показали, что более низкая доступность в почве Ca, Mg, K и P может быть пагубной для роста и развития сельскохозяйственных культур в кислых почвах 46,47 . Более того, производство сельскохозяйственных культур ограничивается уже при значениях pH ниже 5,5–6,5 48 . В этих агроклиматических условиях ризобактерии, способствующие росту растений, представляют собой полезную альтернативу агрохимикатам для лучшего роста и развития сельскохозяйственных культур как с помощью прямых, так и косвенных механизмов. 2 . В ризосфере чая обитают разнообразные ризобактерии, способствующие росту растений, которые могут использоваться в качестве биоудобрений в устойчивой сельскохозяйственной практике в аналогичных агроклиматических условиях 12,13,14,15,16,18,49 .Поэтому мы стремились выделить, охарактеризовать и изучить чай PGPR на предмет их потенциала в стимулировании роста растений и биоуправлении с использованием двух наиболее важных продовольственных зерновых культур в регионе Дарджилинг.

В настоящем исследовании в общей сложности 120 уникальных ризобактерий были выделены из образцов почвы, собранных в семи чайных плантациях Дарджилинга, Западная Бенгалия, Индия (рис. 1) с использованием различных сред обогащения. Затем все изоляты ризобактерий были подвергнуты функциональному скринингу на определенных средах для оценки их потенциала, способствующего росту растений (PGP), и в конечном итоге было отобрано тридцать чистых культур ризобактерий для дальнейшего анализа.На момент проведения биохимических и микробиологических исследований было обнаружено, что шестнадцать изолятов похожи на Bacillus (16 различных штаммов). Все они оказались спорообразующими, грамположительными, каталазоположительными и палочковидными бактериями (данные не показаны). Кроме того, микробиологические анализы выявили несколько грамположительных бактериальных изолятов шаровидной (похожей на виноград под микроскопом) формы Staphylococcus (данные не показаны). В целом микробиологическая оценка почвы чайной ризосферы показала, что количество бактерий колеблется от 2 × 10 4 до 2 × 10 7 .Количество штаммов ризобактерий, выделенных из ризосферных почв каждого чайного хозяйства, суммировано в таблице 1 вместе с pH и структурой почвы, измеренными в соответствии с методиками USDA.

Чтобы определить идентичность изолятов ризобактерий чая, ген 16S рРНК был частично амплифицирован, и было выполнено секвенирование, как описано в разделе, посвященном методам. Секвенирование и анализ ДНК с использованием инструмента BLAST показали, что все 30 изолятов ризобактерий имеют идентичность в диапазоне от 97.88% до 100% с доступными последовательностями гена 16S рРНК в GenBank (таблица 2). Кроме того, филогенетический анализ показал, что эти 30 изолятов ризобактерий представляют девять различных родов (рис. 2). Из этих 30 изолятов 16 (53,3%) изолятов принадлежат к роду Bacillus, 5 (16,6%) представляют род Staphylococcus, 3 (10%) представляют род Ochrobactrum и по 1 (3,3%) изолята каждый принадлежит к родам Pseudomonas, Lysinibacillus, Micrococcus, Leifsonia, Exiguobacterium и Arthrobacter (таблица 2 и рис.2). Предыдущие исследования показали, что в культивируемой популяции ризобактерий в ризосфере чая доминируют Bacillus родов 12,14,15,49 . Более того, роды Bacillus являются доминирующими культивируемыми представителями в ризосферной почве различных растений, например, риса, пшеницы, табака, Panax notoginseng (китайский женьшень) и т. Д. 50,51,52,53 .

Таблица 2, молекулярная идентичность выделенных ризобактерий чая, основанная на гене 16S рРНК, их порядковые номера и сайты выделения. Рисунок 2

Соседнее филогенетическое дерево, показывающее филогенетические отношения между изолятами ризобактерий на основе последовательностей гена 16S рРНК. Последовательность 16S рРНК Sulfolobus solfataricus P2 была использована для определения вида вне группы.

Активность, способствующая росту растений in vitro

Тридцать отобранных изолятов ризобактерий были оценены in vitro на предмет свойств, которые, как известно, необходимы для активности бактерий, способствующих росту растений, таких как производство ИУК, солюбилизация фосфатов, производство сидерофоров и аммиака. производство.

Ризобактерии, способствующие росту растений, часто продуцируют индолуксусную кислоту (ИУК) и тем самым способствуют росту растений. Биосинтез бактериальной ИУК происходит либо триптофан-зависимым, либо независимым образом. Из 30 изолятов ризобактерий 21 (70%) показал продукцию ИУК на уровне 20 мкг / мл -1 или более при выращивании в присутствии 100 мкг / мл -1 L-триптофана (Таблица 3). Было обнаружено, что некоторые из изолятов ризобактерий (AB304, AB312, AB328 и AB331) синтезируют 90 мкг / мл -1 или более IAA, причем AB331 синтезирует максимальное количество (134.67 ± 3,59 мкг мл -1 ) (Таблица 3). Ранее сообщалось о биосинтезе ИУК с использованием триптофана в различных штаммах PGPR 54 . Предыдущие исследования показали, что ризобактерии чая эффективны в производстве ИУК в присутствии триптофана 15,16 . Однако в настоящем исследовании мы также определили продукцию ИУК ризобактериями в отсутствие триптофана. В отсутствие триптофана 8 (26,6%) изолятов показали продукцию ИУК 20 мкг / мл -1 или более, при этом AB304 был самым высоким (55.17 ± 5,42 мкг мл -1 ) (Таблица 3).

Таблица 3 Функциональный скрининг отобранных ризобактерий чая на предмет PGP in vitro и противогрибковой активности.

Микроорганизмы участвуют в естественном круговороте фосфора, растворяя осажденный и фиксированный фосфор, присутствующий в различных типах почвы, в зависимости от pH. В кислой почве чайной плантации фосфор фиксируется свободными оксидами и гидроксидами алюминия и железа, что приводит к низкой доступности растворимого фосфата 55 .В настоящем исследовании было обнаружено, что большинство изолятов ризобактерий являются эффективными солюбилизаторами фосфатов и, следовательно, обладают потенциалом использования в качестве стимуляторов роста растений. Примерно 11 (36,6%) изолятов показали солюбилизацию фосфата на уровне 400 мкг / мл -1 или более, причем AB345 был наиболее эффективным солюбилизатором фосфата (841,42 ± 10,89 мкг / мл -1 ) (Таблица 3). Предыдущие исследования показали, что солюбилизация фосфатов чайным PGPR сопровождается понижением pH в среде 15,16 .В настоящем исследовании мы наблюдали значительное снижение pH среды, связанное с солюбилизацией фосфата in vitro выбранным PGPR. Мы полагаем, что производство органических кислот с помощью PGPR облегчило солюбилизацию нерастворимых фосфатов. Ранее было показано, что органические кислоты, такие как глюконовая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, янтарная кислота, муравьиная кислота, лимонная кислота, малоновая кислота и винная кислота, часто участвуют в эффективной солюбилизации неорганического фосфата 56 .

Отобранные изоляты ризобактерий оказались высокоэффективными продуцентами сидерофоров. Было обнаружено, что продукция сидерофоров изолятами составляет от 52 до 99% сидерофорных единиц (таблица 3). Было обнаружено, что около 70% (21 изолят) изолятов ризобактерий демонстрируют продукцию сидерофоров более чем на 90% или более единиц сидерофоров (Таблица 3). В целом, ризобактериям необходимы стратегии для выживания в высококонкурентной микроэкологической зоне ризосферы. Среди многих стратегий, принятых ризобактериями, биосинтез сидерофоров является одной из важнейших стратегий, где ризобактерии подавляют рост фитопатогенных бактерий или грибов или не ризосферных бактерий, лишая их необходимого железа в микроокружении ризосферы 57 .Предыдущие исследования показали, что чай PGPR из Ассама и Дарджилинга эффективен в производстве сидерофоров, и наши результаты хорошо подтверждают предыдущие выводы 15,16 .

Производство аммиака PGPR — одна из важнейших характеристик, связанных с стимулированием роста растений. В целом было показано, что аммиак, производимый PGPR, доставляет азот их растениям-хозяевам и тем самым способствует удлинению корней и побегов и их биомассе 58 . В настоящем исследовании продукция аммиака изолятами ризобактерий наблюдалась в диапазоне 2.От 5 мкмоль мл -1 до 7,54 мкмоль мл -1 (таблица 3). Около 67% (20 изолятов) показали продукцию аммиака более 4 мкмоль мл -1 , и было обнаружено, что изолят AB331 продуцирует наибольшее количество аммиака (7,54 мкмоль мл -1 ).

В совокупности выбранные изоляты PGPR чая оказались высокоэффективными в различных активностях PGP in vitro и продемонстрировали возможности в отношении активностей, стимулирующих рост in planta.

Противогрибковая (антагонистическая) активность

В последние годы применение PGPR для смягчения биотического стресса привлекло большое внимание.Такое применение может помочь как в стимулировании роста, так и в борьбе с болезнями растения-хозяина, тем самым повышая урожайность сельскохозяйственных культур для удовлетворения глобального спроса. Все отобранные изоляты ризобактерий были проверены на противогрибковую активность против двух грибковых патогенов, а именно. некротрофный патоген риса R. solani AG1-IA и биотрофный патоген кукурузы U. maydis SG200, соответственно. Из 30 выбранных ризобактерий 18 (60%) изолятов оказались активными против R.solani AG1-IA (таблица 3) и 21 (70%) изолят были активны против U. maydis SG200 (данные не представлены). Было обнаружено, что семнадцать изолятов ризобактерий проявляют активность против обоих грибковых патогенов, протестированных в настоящем исследовании. Все 30 изолятов дополнительно оценивали на активность протеаз, целлюлазы и АСС дезаминазы. В то время как различные гидролитические ферменты, такие как протеазы и целлюлазы, помогают в биоконтроле, способствуя деградации клеточной стенки грибов, дезаминаза ACC, продуцируемая ризобактериями, способствует росту растений путем связывания и расщепления 1-аминоциклопропан-1-карбоксилата (ACC), продуцируемого в растениях в условиях биотических и абиотических стрессов 59,60 .Среди изолятов 21 (70%) проявили протеазную активность, 8 (26,6%) продемонстрировали целлюлазную активность и 12 (40%) проявили активность АСС дезаминазы (Таблица 3). С этой целью большинство выбранных изолятов ризобактерий обладают необходимым арсеналом, чтобы действовать как возможные агенты биоконтроля. Поэтому мы стремились проверить их способность действовать как агенты биоконтроля в наших последующих экспериментах.

Оценка активности стимуляции роста растений в лабораторных условиях

Эксперименты по стимулированию роста растений с использованием изолятов ризобактерий показали, что внесение почти всех выбранных ризобактерий привело к увеличению биометрических параметров растений (т.е.влажный вес, сухой вес, длина побегов и длина корней) проростков риса и кукурузы статистически значимо (рис. 3 и рис. S1). В настоящем исследовании Bacillus был самым многочисленным представителем культивируемых изолятов ризобактерий чая. Было обнаружено, что все 16 (53,33%) изолятов родов Bacillus вызывают значительное увеличение сырой массы, сухой массы, длины побегов и длины корней как у проростков риса, так и кукурузы (рис. 3 и рис. S1). Несколько видов рода Bacillus, например B.amyloliquefaciens , B. aryabhattai , B. circans , B. coagulans , B. licheniformis , B. megaterium , B. subtilis , B. thuringiensis и B. velezensis были ранее идентифицированы и охарактеризованы как PGPR и агенты биологического контроля 1,12,14,61,62 . Они способствуют росту растений с помощью различных прямых и косвенных механизмов, включая фиксацию азота, солюбилизацию фосфатов и калия, производство фитогормонов, производство сидерофоров, биосинтез антимикробных и гидролитических ферментов, стимуляцию индуцированной системной устойчивости (ISR) и систему антиоксидантной защиты растений 62 .В настоящем исследовании мы оценили стимулирующую рост растений активность нескольких известных PGPR рода Bacillus, а именно: B. atrophaeus AB228, B. velezensis AB230, B. velezensis AB237, B. cereus AB236 , B. altitudinis AB242, B. wiedmannii AB246, B. flexus AB255, B. subtilis AB267, B. nitratireducens AB304, B. magatarium AB320, B. thuringiensis AB341 ( Инжир.3 и рис. S1) 61 . Кроме того, мы также обнаружили несколько новых членов, относящихся к роду Bacillus, например, B. niacini AB209, B. nakamurai AB214, Bacillus sp. AB233, B. pumilus , AB276, , B. paralicheniformis, , AB330, как потенциальные изоляты ризобактерий, стимулирующие рост растений (рис. 3 и рис. S1). Предыдущие исследования показали, что род Bacillus доминирует в культивируемой части популяции ризобактерий чая Дарджилинг и может использоваться в качестве PGPR и агентов биоконтроля 15,63 .В этом исследовании, помимо Bacillus, были представлены такие представители рода, как Arthobacter ( Arthrobacter sp. AB200), Exiguobacterium ( Exiguobacterium mexicanum AB201), Leifsonia ( Leifsonia lichenia AB203), Lysinibacillus AB203 ( Micrococcus luteus AB321), Ochrobactrum ( Ochrobactrum anthropi AB285, Ochrobactrum haematophilum AB286, Ochrobactrum haematophilum AB345), Pseudomonas Pseudochylocapcus Pseudochylocapcus Pseudochylocapcus Pseudochylocochypusa и Stutomochypusa Pseudochylopusa stut2 AB312, Staphylococcus gallinarum AB328, Staphylococcus saprophyticus AB331, Staphylococcus haemolyticus AB336 также увеличивают биометрические параметры растений (а именно.влажный вес, сухой вес, длина побегов и длина корней) как у проростков риса, так и кукурузы (рис. 3 и рис. S1). Насколько нам известно, среди этих изолятов представители рода Arthrobacter ( Arthrobacter sp. AB200), Exiguobacterium ( Exiguobacterium mexicanum AB201), Leifsonia ( Leifsonia lichenia AB203) и Lysinibacinis AB203 были выделен из чайной ризосферы Дарджилинга и впервые протестирован на активность PGP.Из тридцати изолятов ризобактерий обработка 27 (90%) изолятов привела к статистически значимому увеличению общего содержания хлорофилла в проростках риса и кукурузы по сравнению с неинокулированными контрольными растениями (рис. 4 и рис. S2).

Рисунок 3

Оценка признаков, способствующих росту растений, при индивидуальной обработке выбранных изолятов ризобактерий чая на сеянцах риса сорта IR64. Пятидневные проростки обрабатывали отдельными изолятами ризобактерий, и параметры роста, такие как ( a ) влажная масса, ( b ) сухая масса, ( c ) длина корней и ( d ) длина побегов были измеряется через 21 день после лечения.Двусторонний t-критерий определил уровень значимости, а данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. ( a : значение P-0,05–0,01, b : значение P 0,01–0,001 и c : значение P менее 0,001).

Рисунок 4

Оценка концентрации хлорофилла при индивидуальной обработке выбранных изолятов ризобактерий чая на проростках риса сорта IR64. Пятидневные проростки обрабатывали отдельными изолятами ризобактерий, и через 21 день после обработки измеряли общую концентрацию хлорофилла.Двусторонний t-критерий определил уровень значимости, а данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. (a: значение P-0,05–0,01, b: значение P 0,01–0,001 и c: значение P менее 0,001).

Влияние обработки PGPR на связанные с защитой ферменты в рисе

Ризобактерии, способствующие росту растений (PGPR), как известно, придают растениям индуцированную системную устойчивость (ISR) к бактериальным, грибковым и вирусным заболеваниям 64 . Было показано, что они вызывают системную защиту растений от патогенов листьев и корней 65,66 .Предыдущие исследования показали, что различные штаммы PGPR защищают растения от различных патогенов, активируя гены защиты растений, кодирующие хитиназу, β-1,3-глюканазу, PAL (фенилаланинаммиаклиазу), CAT (каталазу), APX (аскорбатпероксидазу), POD (пероксидазу). ) и другие ферменты, многие из которых действуют как поглотители первичных активных форм кислорода (АФК) 67 . В настоящем исследовании мы изучили статус активности APX, CAT, хитиназы и PAL в растениях риса, обработанных PGPR (рис.5 и рис. S3).

Рисунок 5

Влияние обработки ризобактериями на ( a ) аскорбатпероксидазу (APX), ( b ) каталазу (CAT), ( c ) хитиназу и ( d ) фенилаланин-аммиак-лиазу ( PAL) в побеговой фракции проростков риса сорта IR64. Пятидневные проростки риса обрабатывали отдельными изолятами ризобактерий, и через 14 дней после обработки измеряли ферменты антиоксидантной защиты в препарате лизата побегов.Двусторонний t-критерий определил уровень значимости, а данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. (a: значение P-0,05–0,01, b: значение P 0,01–0,001 и c: значение P менее 0,001).

Фермент аскорбатпероксидаза детоксифицирует H 2 O 2 , образующийся как побочный продукт антиоксидантных механизмов, и превращает его в воду в хлоропласте, цитоплазме и митохондриях 9,68 . Предполагается, что повышенная активность APX вносит вклад в детоксикацию увеличенного накопления H 2 O 2 в клетках 63 .Растения, инокулированные изолятами ризобактерий чая, показали различную активность APX в побегах и корнях соответственно. В лизате побегов активность APX была значительно увеличена у растений, обработанных 12 изолятами ризобактерий (40%) (P ≤ 0,05–0,001) (рис. 5а). В случае изолятов AB237, AB242 и AB285 активность APX в лизате побегов оказалась максимальной среди обработанных растений (P ≤ 0,001) (рис. 5а). В случае корневого лизата значительное усиление активности APX было очевидно для 13 изолятов ризобактерий (43.3%) (P ≤ 0,05–0,001) (рис. S3a). Было обнаружено, что обработка изолятами AB212, AB236, AB246 и AB255 показывала максимальную активность APX в лизатах корней обработанных растений (P ≤ 0,001) (рис. S3a). Вместе измерения активности APX показали, что около 40% и 43,3% изолятов ризобактерий показали статистически значимое усиление активности APX в побегах и / или корнях обработанных растений.

Каталаза (CAT) действует как клеточный поглотитель H 2 O 2 и катализирует его диспропорционирование в H 2 O и O 2 69 .Из 30 изолятов ризобактерий 16 (53,3%) показали статистически значимое повышение активности CAT в лизатах побегов растений по сравнению с необработанным контролем (P ≤ 0,05–0,001) (рис. 5b). Было обнаружено, что среди этих изолятов AB201 и AB237 индуцируют максимальную активность CAT в побегах растений (P ≤ 0,001) (рис. 5b). В то время как в лизатах корней активность CAT была значительно выше у растений, обработанных 14 изолятами ризобактерий (46,6%) (P ≤ 0,05–0,001) (рис. S3b).Среди этих изолятов обработка AB237 показала максимальное увеличение активности CAT в корнях растений (P ≤ 0,001) (рис. S3b). В совокупности было обнаружено, что активность CAT значительно увеличивалась в побегах и корнях обработанных растений при обработке примерно 53,3% и 46,6% изолятов ризобактерий.

Хитиназы входят в состав белков, связанных с патогенами растений. Эти ферменты сильно индуцируются, когда растение заражено грибковым патогеном или из-за стимуляции индуцированной системной устойчивости (ISR) в результате взаимодействия PGPR-растение 5,70 .Хитиназы действуют как важный арсенал для смягчения грибковой инфекции у растений путем прямого литического действия на клеточные стенки грибов или путем стимуляции различных защитных механизмов растений путем высвобождения сигнальных молекул олигосахаридов 70 . Среди отобранных ризобактерий 19 изолятов (63,3%) показали значительное увеличение активности хитиназы в побегах обработанных растений риса (P ≤ 0,05–0,001) (рис. 5c). Обработка изолятами AB214 и AB285 приводила к статистически наиболее значительному увеличению активности хитиназы (P ≤ 0.001) (рис. 5в). В отличие от побегов, лизаты корней обработанных растений показали значительное повышение активности хитиназы при обработке 15 изолятами ризобактерий (50%) (P ≤ 0,05–0,001) (рис. S3c). Кроме того, обработка AB228 и AB233 показала максимальную индукцию активности хитиназы в корне обработанных растений (P ≤ 0,001) (рис. S3c). В целом, при обработке примерно 63,3% и 50% изолятов ризобактерий было очевидно значительное увеличение активности хитиназы в побегах и корнях обработанных растений.

Фенилаланин-аммиачная лиаза (PAL) — важный фермент, который помогает растениям смягчать различные стрессовые условия. 5,67 . PAL предлагает физиологическую и структурную поддержку растений, превращая L-фенилаланин в аммиак и транс-коричную кислоту. Было показано, что обработка риса микробами увеличивает активность PAL и накопление полифенолов в листьях и тем самым помогает улучшить стрессовые условия (засуха, засоление и т. Д.). 67 . В настоящем исследовании мы наблюдали, что в большинстве случаев обработка ризобактериями приводила к усилению активности фермента PAL в лизатах побегов риса.В случае 26 изолятов ризобактерий (86,6%) статистически значимое увеличение активности PAL было отмечено для образцов побегов обработанных растений риса (P ≤ 0,05–0,001) (рис. 5d). Однако наиболее значительная активность PAL была зарегистрирована в образцах побегов растений, обработанных изолятами AB228, AB267, AB276 и AB336 (P ≤ 0,001) (рис. 5d). В образцах корней было обнаружено, что активность PAL увеличивалась при обработке 16 изолятами ризобактерий (53,3%) (P ≤ 0,05–0,001) (рис. S3d). Из изолятов ризобактерий обработка AB267 и AB341 показала максимальную активность PAL в образцах корней обработанных растений (P ≤ 0.001) (Рис. S3d). В совокупности наш анализ показал, что около 86,6% изолятов ризобактерий увеличивают активность PAL в областях побегов, в то время как только 53,3% изолятов могут способствовать активности PAL в области корней обработанных растений риса.

В конце концов, повышенная активность связанных с защитой ферментов, таких как APX, CAT, хитиназа и PAL, в обработанных PGPR растениях риса привело нас к предположению, что (i) обработка ризобактериями может стимулировать индуцированную системную резистентность (ISR), a состояние повышенной защитной способности растений риса, и (ii) изоляты ризобактерий способны модулировать активность ферментов, связанных с защитой, и тем самым помогают растению подготовиться к будущим испытаниям с биотическими и абиотическими стрессами.Доступна ограниченная информация о том, как PGPR из ризосферы чая модулируют защитные пути в растениях-хозяевах 17,71 . Насколько нам известно, это, возможно, первое сообщение о модуляции активности ферментов, связанных с защитой, PGPR чая параллельно с их типичными свойствами, способствующими росту растений.

Накопление пролина и полифенолов в инокулированных растениях риса

АФК, поглощая небольшие метаболиты, такие как каротиноиды, фенолы, пролин и токоферол, поддерживают окислительно-восстановительный баланс в клетках во время окислительного повреждения 72 .Обработка PGPR увеличивает концентрацию пролина и полифенолов, что обычно способствует улавливанию ROS в растениях 73 . В настоящем исследовании мы измерили концентрацию пролина и полифенолов в обработанных растениях риса.

Пролин — отличный осмолит, который помогает в стабилизации субклеточных макромолекул, таких как белки и клеточные мембраны. Кроме того, он участвует в улавливании свободных радикалов, балансировании окислительно-восстановительного гомеостаза и передачи сигналов, тем самым помогая растениям справляться со стрессовыми условиями 74 .Было обнаружено, что 18 изолятов ризобактерий (60%) вызывают статистически значимое увеличение концентрации пролина в образцах побегов обработанного риса по сравнению с необработанными контрольными растениями (P ≤ 0,05–0,001) (рис. 6a). Изоляты AB321 вызывали наиболее значительное увеличение концентрации пролина в побегах обработанных растений риса (P ≤ 0,001) (рис. 6а). В случае того же набора обработок анализ образцов корней показал, что 14 изолятов ризобактерий (46,6%) вызвали статистически значимое увеличение содержания пролина (P ≤ 0.05–0.001), причем изолят AB228 является наиболее эффективным (P ≤ 0.001) (рис. 6б). В совокупности оценки пролина в растениях риса, обработанных ризобактериями, показали, что в большинстве обработок концентрация пролина была увеличена в образцах побегов (60%), а также в образцах корней (46,6%), что указывает на возможное праймирование (как местное, так и системное) с помощью PGPR. растениям предстоит столкнуться с будущими проблемами биотических и абиотических стрессов.

Рисунок 6

Влияние обработки ризобактериями на ( a ) содержание пролина в побегах и ( b ) содержание пролина в корнях в проростках риса сорта IR64.Пятидневные проростки риса обрабатывали отдельными изолятами ризобактерий и измеряли молекулы антиоксидантной защиты через 14 дней после обработки. Двусторонний t-критерий определил уровень значимости, а данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. (a: значение P-0,05–0,01, b: значение P 0,01–0,001 и c: значение P менее 0,001).

Показано, что накопление полифенолов в листьях растений играет защитную роль против биотических и абиотических стрессов за счет антиокисления и дезактивации АФК 67 .Обработка микробами влияет на накопление полифенолов в листьях растений 75 . Являясь мощным антиоксидантом, высокое накопление полифенолов в листьях должно усиливать стрессоустойчивость растений. 75 . В настоящем исследовании мы измерили общее накопление полифенолов в обработанных растениях риса. Наш анализ показал, что при обработке 23 изолятами ризобактерий (76,6%) в листьях наблюдалось статистически значимое увеличение общего количества полифенолов (P ≤ 0.05–0.001) (рис. 7). Однако обработка изолятами AB304 вызвала наиболее значительный эффект с точки зрения измерения общих полифенолов в листьях (P ≤ 0,001) (рис. 7). В совокупности накопление полифенолов наблюдалось в большинстве обработок (76,6%), что указывает на возможное усиление антиоксидантов в растениях.

Рисунок 7

Влияние обработки ризобактериями на накопление общего количества полифенолов в проростках риса сорта IR64. Пятидневные проростки риса обрабатывали отдельными изолятами ризобактерий и измеряли молекулы антиоксидантной защиты через 14 дней после обработки.Двусторонний t-критерий определил уровень значимости, а данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. (a: значение P-0,05–0,01, b: значение P 0,01–0,001 и c: значение P менее 0,001).

Повышенная устойчивость растений риса, предварительно обработанных PGPR, к инфекции кожного ожога

Чтобы оценить, действительно ли повышенная активность защитных ферментов в рисе из-за предварительной обработки PGPR участвует в индукции устойчивости к болезням, мы изучили инфекцию фитофтороза у риса, предварительно обработанного PGPR. и необработанные условия.PGPR были распределены в шести консорциумах (таблица S1), и проростки риса были предварительно обработаны каждым из этих шести консорциумов отдельно перед заражением R. solani AG1-IA. На Фигуре 8 показан положительный ответ относительно повышенной устойчивости риса в случае каждого из шести консорциумов. Однако степень устойчивости, индуцированной у растений риса, варьировалась в зависимости от индивидуальных консорциумов, используемых для предварительной обработки. Как, например, группы I, V и VI показали максимальный эффект с примерно 60-70-процентным снижением DI.Во всех этих случаях DI находился в диапазоне от 0,3 до 0,4. Группа III показала умеренный эффект с DI 0,42, а группы II и IV показали наименьшее влияние. В то время как предварительная обработка консорциума группы IV привела к DI, равному 0,65, обработанные в группе II растения риса показали DI 0,72 при заражении R. solani AG1-IA. Среди созданных консорциумов многовидовых ризобактерий группа I оказалась наиболее эффективной в борьбе с инфекцией R. solani AG1-IA. В группу I вошли Arthrobacter sp.AB200, Staphylococcus pasteuri AB212, Bacillus sp. AB233, Bacillus altitudinis AB242 и Pseudomonas stutzeri AB266 (Таблица S1). Из пяти изолятов ризобактерий в группе I Arthobacter sp. Ранее было показано, что он подавляет рост патогена картофеля in vivo.altitudinis оказался эффективным против болезни корневой гнили, вызываемой Thanatephorus cucumeris 78 . Кроме того, группы V и VI также оказались высокоэффективными в борьбе с инфекцией R. solani риса (рис. 8). Члены группы V, например, B. subtilis , B. thuringiensis , B. pumilus и S. gallinarum , являются хорошо известными агентами биоконтроля против ряда фитопатогенов 79,80,81,82 .Члены группы VI представляют собой сравнительно менее охарактеризованные виды ризобактерий (Таблица S1), и такие представители, как B. paralicheniformis , Lysinibacillus fusiformis и Ochrobactrum sp. недавно сообщалось о деятельности по биологическому контролю 83,84,85 .

Рисунок 8

Влияние обработки ризобактериями на относительные индексы заболевания (DI) бактериального ожога у проростков риса сорта IR64. Пятидневные проростки риса обрабатывали отдельными консорциумами ризобактерий (как описано в таблице S1), и обработанные растения выращивали при 24 ° C при 16-8-часовом цикле день-ночь в течение трех дней.После этого проростки инокулировали R. solani AG1-IA, как описано в разделе, посвященном методам. Зараженные таким образом проростки риса выращивали в течение двух дней, и симптомы инфекции оценивали как индекс заболевания (DI). Рассчитывали DI всех обработанных образцов и сравнивали с DI для контроля, чтобы оценить влияние соответствующих консорциумов на индуцирование устойчивости проростков риса. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение, рассчитанное по трем независимым экспериментам.

Эффективность инокуляции микроплантатов картофеля, выращенных in vitro, ризосферными бактериями рода Azospirillum

  • Ali B (2015) Бактериальная передача сигналов ауксина: сравнительное исследование индукции роста у Arabidopsis thaliana и Triticum aestivum . Turk J Bot 39: 1–9. https://doi.org/10.3906/bot-1401-31

    CAS Статья Google ученый

  • Али Б., Сабри А.Н., Люнг К., Хаснаин С. (2009) Производство ауксина ассоциированными с растениями бактериями: влияние на эндогенное содержание ИУК и рост Triticum aestivum L.Lett Appl Microbiol 48: 542–547. https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2009.02565.x

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Алони Р., Алони Э., Лангханс М., Ульрих К.И. (2006) Роль цитокинина и ауксина в формировании архитектуры корня: регулирование дифференциации сосудов, инициация бокового корня, апикальное доминирование корня и гравитропизм корня. Энн Бот 97: 883–893. https://doi.org/10.1093/aob/mcl027

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • Архипова Т.Н., Анохина Н.Л. (2009) Влияние инокуляции растений пшеницы цитокинин-продуцирующими микроорганизмами на рост растений при повышении уровня минерального питания.Русс Дж. Физиология растений 56: 814–819. https://doi.org/10.1134/S102144370

  • 19

    CAS Статья Google ученый

  • Assmus B, Hutzler P, Kirchhof G, Amann R, Lawrence JR, Hartmann A (1995) Локализация на месте Azospirillum brasilense в ризосфере пшеницы с помощью флуоресцентно меченных, направленных на рРНК олигонуклеотидных сканирующих лазерных зондов микроскопия. Appl Environ Microbiol 61: 1013–1019

    CAS Статья Google ученый

  • Badoni A, Bisht C, Chauhan JS (2010) Микроразмножение Hedychium spicatum Smith с использованием кончика побега in vitro.Стволовая клетка 1: 11–13

    Google ученый

  • Балдани В.Л., Балдани Д.И., Дёберейнер Дж. (1983) Влияние инокуляции азоспирилл на корневую инфекцию и включение азота в пшеницу. Может J Microbiol 29: 924–929. https://doi.org/10.1139/m83-148

    Артикул Google ученый

  • Balla I, Vertesy J, Köves-Pechy K, Vörös I, Bujtas Z, Biro B (1998) Результаты акклиматизации микроразмножающейся черной акации ( Robinia pseudoacacia L.) улучшены симбиотическими микроорганизмами. Культ органа растительной клетки, ткани 52: 113–115. https://doi.org/10.1023/A:1005974024515

    Артикул Google ученый

  • Bartolini S, Carrozza GP, Scalabrelli G, Toffanin A (2017) Эффективность Azospirillum brasilense Sp245 на молодых растениях Vitis vinifera L. Open Life Sci 12: 365–372. https://doi.org/10.1515/biol-2017-0042

    CAS Статья Google ученый

  • Башан Й, де-Башан Л. Е., Прабху С. Р., Эрнандес Дж. П., (2014) Достижения в технологии бактериальных инокулянтов, способствующих росту растений: составы и практические перспективы (1998–2013).Почва для растений 378: 1–33. https://doi.org/10.1007/s11104-013-1956-x

    CAS Статья Google ученый

  • Белимов А.А., Кожемяков А.П., Чуварлиева Г.В. (1995) Взаимодействие ячменя со смешанными культурами азотфиксирующих и фосфатосолюбилизирующих бактерий. Почва для растений 173: 29–37. https://doi.org/10.1007/BF00155515

    CAS Статья Google ученый

  • Бойкова Н.В., Ткаченко О.В., Евсеева Н.В., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю. (2015) Создание ассоциации in vitro картофеля с бактериями рода Azospirillum .Agrar Sci J 7: 3–7

    Google ученый

  • Bunn E, Tan B (2002) Микробные контаминанты при размножении культур тканей растений. В: Sivasithamparam S (eds) Микроорганизмы в сохранении растений и биоразнообразии. Springer, Dordrecht, стр. 307–335. https://doi.org/10.1007/0-306-48099-9_12

  • Бурыгин Г.Л., Каргаполова К.Ю., Крючкова Ю.В., Авдеева Е.С., Гоголева Н.Е., Пономарева Т.С., Ткаченко О.В. (2019) Ochrobactrum cytisi IPA7.2 способствует росту микропланшетов картофеля и устойчив к абиотическому стрессу. Мир J Microbiol Biotechnol 35:55. https://doi.org/10.1007/s11274-019-2633-x

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Батт С.Дж., Варис С., Насир И.А., Шераз С., Шахид А. (2015) Микроразмножение в передовом овощеводстве: обзор. Adv Life Sci 2: 48–57

    CAS Google ученый

  • Chou JC, Huang YB (2005) Индукция и характеристика индол-3-ацетил-L-аланин гидролазы из Arthrobacter ilicis .J Регламент роста растений 24: 11–18. https://doi.org/10.1007/s00344-005-0013-2

    CAS Статья Google ученый

  • Chou JC, Mulbry WW, Cohen JD (1998) Ген гидролазы индол-3-ацетил-L-аспарагиновой кислоты из Enterobacter agglomerans : молекулярное клонирование, нуклеотидная последовательность и экспрессия в Escherichia coli . Mol Gen Genet 259: 172–178. https://doi.org/10.1007/s004380050802

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Chugh S, Guha S, Rao IU (2009) Микроразмножение орхидей: обзор возможностей различных эксплантов.Sci Hortic 122: 507–520. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2009.07.016

    CAS Статья Google ученый

  • Додд И.С., Зиновкина Н.Ю., Сафронова В.И., Белимов А.А. (2010) Ризобактериальное опосредование гормонального статуса растений. Энн Аппл Биол 157: 361–379. https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.2010.00439.x

    CAS Статья Google ученый

  • Duca D, Rose DR, Glick BR ​​(2014) Характеристика нитрилазы и нитрилгидратазы из Pseudomonas sp.штамм UW4, который превращает индол-3-ацетонитрил в индол-3-уксусную кислоту. Appl Environ Microbiol 80: 4640–4649. https://doi.org/10.1128/AEM.00649-14

    CAS Статья PubMed PubMed Central Google ученый

  • Elías JM, Guerrero-Molina MF, Martínez-Zamora MG, Díaz-Ricci JC, Pedraza RO (2018) Роль этилена и экспрессии родственных генов во взаимодействии между растениями клубники и бактериями, способствующими росту растений Azospirillum brasilense .Биол растений 20: 490–496. https://doi.org/10.1111/plb.12697

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Евсеева Н.В., Ткаченко О.В., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Лобачев Ю.В., Щеголев С.Ю. (2018) Влияние бактериальных липополисахаридов на морфогенетическую активность соматических каллусов пшеницы. Мир J Microbiol Biotechnol 34: 3. https://doi.org/10.1007/s11274-017-2386-3

    CAS Статья Google ученый

  • Евсеева Н.В., Ткаченко О.В., Денисова А.Ю., Бурыгин Г.Л., Веселов Д.С., Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. (2019) Функционирование растительно-бактериальных ассоциаций в условиях осмотического стресса in vitro.Мир J Microbiol Biotechnol 35: 195. https://doi.org/10.1007/s11274-019-2778-7

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Филипьева Ю.А., Бурыгин Г.Л. (2016) Серологические и ростостимулирующие свойства штаммов Azospirillum , выделенных в Саратовской области. Agrar Sci J 3: 44–48

    Google ученый

  • Gouda S, Kerry RG, Das G, Paramithiotis S, Shin HS, Patra JK (2018) Возрождение ризобактерий, способствующих росту растений, для устойчивого развития сельского хозяйства.Microbiol Res 206: 131–140. https://doi.org/10.1016/j.micres.2017.08.016

    Артикул PubMed Google ученый

  • Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST (eds) (1994) Руководство Берги по детерминантной бактериологии, 9-е изд. Williams & Wilkins, Baltimore

  • Jha CK, Saraf M (2015) Ризобактерии, способствующие росту растений (PGPR): обзор. J Agric Res Dev 5: 108–119

    Google ученый

  • Khammas KM, Ageron E, Grimont PAD, Kaiser P (1989) Azospirillum irakense sp.nov., азотфиксирующая бактерия, связанная с корнями риса и ризосферной почвой. Res Microbiol 140: 679–693. https://doi.org/10.1016/0923-2508(89)-X

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Крицкая Т.А., Евсеева Н.В., Бурыгин Г.Л., Кашин А.С., Щеголев С.Ю. (2017) Использование Azospirillum brasilense Sp245 для повышения эффективности клонального микроразмножения меловой ловушки ( Silene cretacea Fis.ex Spreng). Биотехнология 33: 72–79. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2017-33-1-72-79

    Артикул Google ученый

  • Kundan R, Pant G, Jadon N, Agrawal PK (2015) Ризобактерии, способствующие росту растений: механизм и текущие перспективы. Дж. Фертил Пестик 6: 155. https://doi.org/10.4172/2471-2728.1000155

    Артикул Google ученый

  • Larraburu EE, Llorente BE (2015) Azospirillum brasilense усиливает in vitro ризогенез Handroanthus impetiginosus (розовый лапачо) в различных питательных средах.Ann For Sci 72: 219–229. https://doi.org/10.1007/s13595-014-0418-9

    Артикул Google ученый

  • Larraburu EE, Yarte ME, Llorente BE (2016) Инокуляция Azospirillum brasilense , индукция ауксина и состав питательной среды изменяют профиль антиоксидантных ферментов во время ризогенеза розового лапахо in vitro. Культ растительных клеток и тканей 127: 381–392. https://doi.org/10.1007/s11240-016-1060-z

    CAS Статья Google ученый

  • Libbert E, Risch H (1969) Взаимодействие между растениями и эпифитными бактериями относительно их метаболизма ауксина: V.Выделение и идентификация продуцирующих и уничтожающих ИУК бактерий из растений гороха. Physiol Plant 22: 51–58. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1969.tb07840.x

    Артикул Google ученый

  • Llorente BE, Larraburu EE (2013) Размножение fraser photinia in vitro с использованием Azospirillum — опосредованного развития корней. В: Lambardi M, et al. (eds), Протоколы для микроразмножения выбранных экономически важных садовых растений (методы в молекулярной биологии).Springer, Berlin, vol 11013, pp 245–258. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-074-8_19

  • Ludwig-Müller J (2011) Конъюгаты ауксина: их роль в развитии растений и в эволюции наземных растений. J Exp Bot 62: 1757–1773. https://doi.org/10.1093/jxb/erq412

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Людвиг-Мюллер Дж. (2015) Бактерии и грибы, контролирующие рост растений, манипулируя ауксином: баланс между развитием и защитой.J. Физиология растений 172: 4–12. https://doi.org/10.1016/j.jplph.2014.01.002

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Марино Г., Алтан А.Д., Биавати Б. (1996) Влияние бактериального загрязнения на рост и газовыделение культивированных in vitro побегов абрикоса. Завод Vitro Cell Dev Biol 32: 51–56. https://doi.org/10.1007/BF02823014

    Артикул Google ученый

  • Мохапатра П.П., Батра В.К. (2017) Тканевая культура картофеля ( Solanum tuberosum L.): Обзор. Int J Curr Microbiol Appl Sci 6: 489–495. https://doi.org/10.20546/ijcmas.2017.604.058

    CAS Статья Google ученый

  • Murashige T, Skoog G (1962) Пересмотренная среда для быстрого роста и биологических анализов с культурами тканей табака. Physiol Plant 15: 473–497. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

    CAS Статья Google ученый

  • Муратова А.Ю., Турковская О.В., Антонюк Л.П., Макаров О.Е., Позднякова Л.И., Игнатов В.В. (2005) Маслоокислительный потенциал ассоциативных ризобактерий рода Azospirillum .Микробиология 74: 210–215. https://doi.org/10.1007/s11021-005-0053-4

    CAS Статья Google ученый

  • Nowak J (1998) Обзор. Преимущества «биотизации» культур тканей растений in vitro микробными инокулянтами. Завод Vitro Cell Dev Biol 34: 122–130. https://doi.org/10.1007/BF02822776

    Артикул Google ученый

  • Новак Дж., Шулаев В. (2003) Прайминг для устойчивости трансплантата к стрессу при размножении in vitro.Завод Vitro Cell Dev Biol 39: 107–124. https://doi.org/10.1079/IVP2002403

    Артикул Google ученый

  • Орликовская Т., Новак К., Рид Б. (2017) Бактерии в среде культуры тканей растений. Культ растительных клеток, тканей и органов 128: 487–508. https://doi.org/10.1007/s11240-016-1144-9

    CAS Статья Google ученый

  • Освальд А., Кальво Велес П., Зунига Давила Д., Аркос Пинеда Дж. (2010) Оценка почвенных ризобактерий на их способность увеличивать рост растений и урожайность клубней картофеля.Ann Appl Biol 157: 259–271. https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.2010.00421.x

    Артикул Google ученый

  • Pereg L, de-Bashan LE, Bashan Y (2016) Оценка сродства и специфичности Azospirillum для растений. Почва растений 399: 389–414. https://doi.org/10.1007/s11104-015-2778-9

    CAS Статья Google ученый

  • Pii Y, Mimmo T, Tomasi N, Terzano R, Cesco S, Crecchio C (2015) Микробные взаимодействия в ризосфере: благотворное влияние ризобактерий, способствующих росту растений, на процесс усвоения питательных веществ.Обзор. Biol Fertil Soils 51: 403–415. https://doi.org/10.1007/s00374-015-0996-1

    CAS Статья Google ученый

  • Позднякова Л.И., Каневская С.В., Леванова Г.Ф., Барышева Н.Н., Пилипенко Т.Ю., Богатырев В.А., Федорова Л.С. (1988) Таксономическое исследование Azospirillum , выделенного из зерновых культур в Саратовской области. Микробиология 57: 222–225

    Google ученый

  • Рао А.В., Венкатесварлу Б. (1982) Ассоциативный симбиоз Azospirillum lipoferum с двудольными суккулентными растениями Индийской пустыни.Может J Microbiol 28: 778–782. https://doi.org/10.1139/m82-118

    CAS Статья Google ученый

  • Рид Б.М., Танпрасерт П. (1995) Обнаружение и контроль бактериальных загрязнителей культур тканей растений. Обзор новейшей литературы. Культ тканей растений Биотехнология 1: 137–142

    Google ученый

  • Reinhold B, Hurek T, Fendrik I, Pot B, Gillis M, Kersters K, Thielemans S, De Ley J (1987) Azospirillum halopraeferens sp.nov., азотфиксирующий организм, связанный с корнями травы каллар ( Leptochloa fusca (L.) Kunth). Int J Syst Evol Microbiol 37: 43–51. https://doi.org/10.1099/00207713-37-1-43

    Артикул Google ученый

  • Сафронова В.И., Степанок В.В., Энгквист Г.Л., Алексеев Ю.В., Белимов А.А. (2006) Связанные с корнем бактерии, содержащие 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатдеаминазу, улучшают рост и усвоение питательных веществ генотипами гороха, выращиваемыми в почве с добавлением кадмия.Biol Fertil Soils 42: 267–272. https://doi.org/10.1007/s00374-005-0024-y

    CAS Статья Google ученый

  • Schum A, Meise P, Jansen G, Seddig S, Ordon F (2017) Оценка характеристик, связанных с азотной эффективностью сортов крахмального картофеля в условиях in vitro. Культ органа растительной клетки, ткани 130: 651–665. https://doi.org/10.1007/s11240-017-1254-z

    CAS Статья Google ученый

  • Шапошников А.И., Белимов А.А., Кравченко Л.В., Виванко Д.М. (2011) Взаимодействие ризосферных бактерий с растениями: механизмы формирования и факторы эффективности ассоциативного симбиоза.Сельскохозяйственная биол 3: 16–22

    Google ученый

  • Spaepen S, Vanderleyden J (2011) Взаимодействие ауксина и микробов с растениями. Cold Spring Harb Perspect Biol 3: a001438. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a001438

    Артикул Google ученый

  • Steenhoudt O, Vanderleyden J (2000) Azospirillum , свободноживущая азотфиксирующая бактерия, тесно связанная с травами: генетические, биохимические и экологические аспекты.FEMS Microbiol Rev 24: 487–506. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2000.tb00552.x

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Tarrand JJ, Krieg NR, Döbereiner J (1978) Таксономическое исследование группы Spirillum lipoferum с описаниями нового рода, Azospirillum gen. ноя и два вида, Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb. ноя и Azospirillum brasilense sp.ноя Может J Microbiol 24: 967–980. https://doi.org/10.1139/m78-160

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Thomas J, Ajay D, Kumar RR, Mandal AKA (2010) Влияние полезных микроорганизмов во время акклиматизации in vivo растений чая, полученных in vitro ( Camellia sinensis ). Культ органа растительной клетки, ткани, 101: 365–370. https://doi.org/10.1007/s11240-010-9687-7

    Артикул Google ученый

  • Ткаченко О.В., Евсеева Н.В., Бойкова Н.В., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Лобачев Ю.В., Щеголев С.Ю. (2015) Улучшение микроклонального воспроизводства картофеля с помощью ростовых ризобактерий Azospirillum .Agron Sustain Dev 35: 1167–1174. https://doi.org/10.1007/s13593-015-0304-3

    CAS Статья Google ученый

  • Vettori L, Russo A, Felici C, Morini S, Toffanin A (2010) Улучшение микроразмножения: влияние Azospirillum brasilense Sp245 на акклиматизацию подвоев плодовых деревьев. J Plant Interact 5: 249–259. https://doi.org/10.1080/17429145.2010.511280

    Артикул Google ученый

  • Волкогон В.В., Димова С.Б., Мамчур А.Е. (2006) Особенности взаимоотношений бактерий рода Azospirillum с растениями картофеля, культивируемыми in vitro.Сельскохозяйственная микробиол 3: 19–25

    Google ученый

  • Woodward AW, Bartel B (2005) Ауксин: регулирование, действие и взаимодействие. Энн Бот 95: 707–735. https://doi.org/10.1093/aob/mci083

    CAS Статья Google ученый

  • Захарова Э., Иосипенко А., Игнатов В.В. (2000) Влияние водорастворимых витаминов на продукцию индол-3-уксусной кислоты Azospirillum brasilense .Microbiol Res 155: 209–214. https://doi.org/10.1016/S0944-5013(00)80034-8

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Zúñiga A, Poupin MJ, Donoso R, Ledger T, Guiliani N, Gutiérrez RA, González B (2013) Чувствительность кворума и разложение индол-3-уксусной кислоты играют роль в колонизации и стимулировании роста растений Arabidopsis thaliana по Burkholderia phytofirmans PsJN. Mol Plant Microbe Interact 26: 546–553.https://doi.org/10.1094/MPMI-10-12-0241-R

    CAS Статья PubMed Google ученый

  • Стимуляция роста растений in vitro штаммов ризобий, выделенных из клубеньков корня чечевицы при абиотических стрессах

    Авторов:

    Бадреддин Сиджилмасси

    Абделькарим Филали-Мальтуф, Сара Фахде, Сара Фахде, Юнес Нахли, Бафрибил Саид, Шив Кумар Агравал, Ахмед Амри

    Известно, что ризобии, способствующие росту растений, улучшают урожайность за счет нескольких механизмов.Однако на взаимодействие между растениями-хозяевами и штаммами Rhizobium сильно влияют условия выращивания, например, жара, холод, засуха, засоленность почвы, дефицит питательных веществ и т. Д. Настоящее исследование было предпринято для оценки использования Rhizobium в качестве стимуляторов роста растений в условиях абиотических стрессовые состояния. Пятнадцать штаммов Rhizobium, выделенных из клубеньков корня чечевицы, были протестированы на активность солюбилизации фосфата (PSA) и продукцию фитогормонов в условиях засухи и соли. Результаты показали, что 15 штаммов Rhizobium были значительными солюбилизаторами фосфатов и продуцентами индол-ацединовой кислоты (IAA) и гиббереллиновой кислоты (GA3) на основе анализа наименьших значимых различий (LSD) (p ≤ 0.05). Самый высокий уровень ПСА был приписан трем штаммам, а именно 1145N5, 1159N11 и 1159N32 с диапазоном от 144,6 до 205,6 P2O5 (мкг / мл). Наибольшая продукция ИУК была зарегистрирована у штамма 686N5 — 57,68 ± 4,25 мкг / мл по сравнению с 50,8667 ± 1,41 мкг / мл и 37,32 ± 12,59 мкг / мл для Rhizobium tropici CIAT 899 и Azospirillum brasilense DSM-1690 соответственно. Штамм 318N2111 продуцировал 329,24 ± 7,84 мкг / мл GA3 по сравнению с 259,84 ± 25,55 мкг / мл для A. brasilense DSM-1690. R. tropici CIAT 899 показал устойчивость к соли (5% NaCl) и засухе (ψ = −2.6 МПа), тогда как штамм 686N5 показал чрезвычайно высокий уровень солеустойчивости (5% NaCl) и умеренный уровень засухоустойчивости (ψ = -0,75 МПа). Эти результаты указывают на разные пути механизмов засухи и солеустойчивости. Оценка активности Rhizobium, способствующей росту растений (PGP), показала различия между жизнеспособностью бактерий и активностью PGP бактерий с точки зрения устойчивости к абиотическому стрессу, когда активность бактерий PGP прерывается до достижения порога устойчивости бактерий.Эти результаты объединяют новую концепцию скрининга PGPR, основанную на активности PGP в условиях абиотического стресса.

    Образец цитирования:

    Бадреддин Сиджилмасси, Абделькарим Филали-Мальтуф, Сара Фахде, Юнес Нахли, Бафрибил Саид, Шив Кумар Агравал, Ахмед Амри. (13.07.2020). Стимуляция роста растений in vitro штаммов ризобий, выделенных из клубеньков корня чечевицы при абиотических стрессах. Агрономия, 10 (7).

    Кожные экзосомы, содержащие miR-218-5p, способствуют регенерации волос, регулируя передачу сигналов β-катенина

    ВВЕДЕНИЕ

    Люди, страдающие умеренным выпадением волос, обращаются к местным препаратам, таким как миноксидил (антигипертензивное средство, открывающее калиевые каналы) ( 1 ) и финастерид (дигидротестостерон). -подавляющий ингибитор 5α-редуктазы) ( 2 ), единственное одобренное Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов средство для стимуляции роста волос.Оба предназначены не для лечения выпадения волос, а для лечения интуиции. Исследователи продолжали изучать механизм циклов волосяных фолликулов и разрабатывать маломолекулярные препараты ( 3 5 ), биопродукты ( 6 ), составы ( 7 , 8 ), лазерную терапию ( 9 ), и хирургическое лечение ( 10 ), поскольку ни миноксидил, ни финастерид не очень эффективны. Миноксидил и финастерид требуют постоянного повторного нанесения пользователем для поддержания роста волос ( 7 ).В своих попытках понять, как отрастают волосы, многие исследователи искали более эффективный подход, сосредоточив внимание на цикле волосяных фолликулов. Они пытались стимулировать прогрессирование фолликулов из фазы покоя (телоген) в активную фазу (анаген) ( 8 ). Вместо трансплантации фолликулярных единиц, которая является дорогостоящей и иногда сталкивается с нехваткой донорских волосяных фолликулов, исследователи попытались использовать клеточную терапию для лечения выпадения волос путем культивирования и размножения клеток волосяных фолликулов или мезенхимальных клеток in vitro, а затем имплантации их в лысину. .В фазе анагена область выпуклости волосяного фолликула является обильным источником активно растущих клеток дермального сосочка (DP), которые выпадают во время фазы покоя. Было высказано предположение, что волосяные фолликулы на лысых участках не исчезают, а уменьшаются в размерах ( 11 ). Пополнение DP-клетками лысых участков, таким образом, является вероятным способом вызвать фазовый переход телоген-анаген, необходимый для индукции роста волос.

    Взаимодействия между эпителиальными и мезенхимальными клетками жизненно важны для регулирования цикла роста волос ( 12 ).В качестве основного мезенхимального компонента фолликулярной единицы клетки DP вызывают переход от телогена к анагену и образование новых фолликулов. Таким образом, регулирование клеток DP имеет решающее значение для увеличения скорости деления клеток и роста фолликулов. Двумерные (2D) культивированные клетки DP не продемонстрировали терапевтического эффекта на рост волосяных фолликулов ( 13 ). Сообщалось, что культуры трехмерных сфероидов приводят к частичному восстановлению индуктивных способностей клеток DP, что может позволить им индуцировать de novo волосяные фолликулы в коже человека ( 13 ).DP-клетки должны агрегироваться в областях волосяных фолликулов, чтобы быть эффективными ( 14 ). Таким образом, терапия с использованием сфероидальных культур должна быть эффективным способом восстановления способности волос к регенерации in vitro. Однако требуется всестороннее понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе этого регенеративного процесса. Клетки DP вызывают развитие цикла и регенерацию волос, что требует взаимодействия с окружающей средой ( 15 ). Экзосомы широко исследовались из-за их роли в межклеточной коммуникации и потенциала в лечении заболеваний ( 16 18 ).Дифференциально экспрессируемый секретом или экзосомы из сфероидов DP и клеток DP могут быть ключом к регулированию циклов волосяных фолликулов. Недавно секретом клеток DP и внеклеточные везикулы ( 8 , 19 , 20 ) продемонстрировали свой эффект в стимулировании роста волос, и их механизм находится в стадии обширных исследований. По сравнению с экзосомами, полученными из мезенхимальных стволовых клеток ( 8 , 21 ), экзосомы, полученные из DP-клеток, оказались эффективными активаторами трансформирующего фактора роста β и оказались важными для стимулирования пролиферации DP-клеток волосяных фолликулов человека и волос рост ( 22 ).Было доказано, что 3D-культура является способом обогащения определенных белков и микроРНК (miRNA) в секретоме ( 23 ). Молодые и соавторы ( 24 ) продемонстрировали, что экзосомы, полученные из клеток 3D DP (3D DP-XOs), способствовали пролиферации клеток DP и клеток оболочки наружного корня и увеличивали экспрессию факторов роста в клетках DP. Однако важность дифференциально экспрессируемого секретома и miRNAs из 2D DP клеток и 3D DP клеток и возможных механизмов 3D DP клеток или 3D DP-XOs в стимулировании регенерации волос не была продемонстрирована.В этом исследовании мы впервые проверили способность сфероидов DP к восстановлению волос у мышей C57BL / 6. Затем терапевтическая эффективность секретома DP сравнивалась с терапевтической эффективностью сфероидов DP. При агрегации клеток DP экспрессируются разные факторы и экзосомы. Принимая во внимание агрегативное поведение клеток DP и способность сфероидов DP индуцировать образование новых волосяных фолликулов in vivo, мы предположили, что дифференциально экспрессируемые факторы и miRNA будут ранее неопределенными терапевтическими средствами для возобновления роста волос.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Сфероиды DP усиливают экспрессию β-катенина и CD133 in vitro и приживление трансплантата in vivo

    Мыши C57BL / 6 широко используются в исследованиях физиологии волос, потому что после депиляции их спины все волосяные фолликулы в этой области переходят в фазу паузы (катаген), когда мыши достигают возраста 7 недель ( 25 , 26 ). Клетки DP выделяли из усов мышей C57BL / 6 ( 27 ) и культивировали. В этом исследовании использовались отрывки с 3 по 6.На рисунке 1А показано, что клетки DP выросли из луковицы волосяного фолликула и имели веретенообразную форму, когда они образовывали спирально-параллельные массивы с центром в луковице. После пассажа клетки DP имели уплощенную многоугольную морфологию (рис. 1B). Сфероиды DP были сформированы путем пассирования клеток DP в колбы сверхнизкого прикрепления. Сфероиды имели диаметр от 150 до 300 мкм (фиг. 1C и фиг. S1) и выражали сильные иммунофлуоресцентные сигналы CD133 (зеленый) и β-катенина (красный; фиг. 1D). Экспрессия CD133 и β-катенина была ниже в 2D культивируемых клетках DP (рис.S2). У сфероидов экспрессия β-катенина была усилена из-за увеличения межклеточного контакта ( 13 ). CD133-положительные клетки DP проявляли способность индуцировать волосы in vivo ( 28 ). Это было дополнительно подтверждено с помощью проточной цитометрии. Повышенную интенсивность сигнала можно увидеть в закрытых сфероидных клетках (рис. S3).

    Рис. 1 Подготовка и характеристика трехмерных сфероидов DP.

    ( A ) Выделение клеток дермального сосочка (DP) мыши из вибрисс.Масштабная линейка 500 мкм. ( B ) Обычная культура позволяет выращивать 2D-клетки DP. Масштабная линейка, 50 мкм. ( C ) Рост сфероидов DP в колбах для сверхнизких культур клеток. Шкала 100 мкм. ( D ) Двойное окрашивание на CD133 (зеленый) и β-катенин (красный) в сфероидах. Шкала 100 мкм. ( E и F ) Изображения кератина (E) и трехмерного кератина, нагруженного сфероидом, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). (F) Один очевидный сфероид выделен желтым цветом. Шкала 100 мкм.( G ) Схема, иллюстрирующая места инъекции на спине мыши для исследования удержания клеток. ( H ) Мыши брили и вводили на кожу спины различные составы, как показано на (G). Клетки метили с помощью DiD, а затем ресуспендировали в PBS или кератине для внутрикожной инъекции. Изображения системы визуализации in vivo (IVIS) были получены в разные моменты времени. ( I ) Количественная оценка изображений IVIS. Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение, n = 3 мыши.Трехмерные сфероиды / кератин показали самое продолжительное время удерживания.

    Для сравнения выживаемости клеток после трансплантации, клетки DP и сфероиды DP, окрашенные DiD (1,1′-диоктадецил-3,3,3 ‘, 3’-тетраметилиндодикарбоцианин, 4-хлорбензолсульфонатная соль), вводили в депилированные спины C57BL / 6 мышей. Каркасы играют важную роль в трехмерной культуре клеток и инженерии ( 29 ). Кератины волос были использованы в качестве каркасов для клеточных культур ( 8 , 30 ), поскольку они аутологичны, разлагаются и биосовместимы.Жизнеспособность клеток DP сохранялась во время инкапсуляции и сохранялась в пористой микроархитектуре кератиновых гидрогелей. Сети кератиновых гидрогелей и сфероидов, самоорганизующихся внутри гидрогелей, показаны на рис. 1 (E и F) соответственно. 2D-клетки или 3D-сфероиды собирали и распределяли в фосфатно-солевом буфере (PBS) или кератиновом гидрогеле (10 5 клеток / 20 мкл) для подкожного введения. Чтобы улучшить выживаемость клеток после трансплантации, мы сравнили клетки DP / PBS, клетки DP / кератин, сфероиды DP / PBS и сфероиды DP / кератин (рис.1G). Визуализация IVIS (система визуализации in vivo) показала, что сфероиды демонстрируют повышенную задержку и выживаемость после инъекции (рис. 1, H и I). Сфероиды обеспечивают более высокую частоту трансплантации и функциональную выгоду ( 31 , 32 ). Кератин также поддерживает прикрепление и пролиферацию клеток ( 8 ). Сфероиды DP / кератиновый гидрогель сохраняли высокую жизнеспособность клеток после приживления на спинной коже мышей.

    сфероидов DP усиливают экспрессию β-катенина, CD133 и Ki67 в волосяных фолликулах in vivo.

    Клетки DP и сфероиды DP вводили в одну сторону каждой мыши после депиляции (10 одноразовых инъекций, равномерно распределенных по обработанным сторона, 10 5 клеток в 20 мкл на инъекцию), или 5% миноксидил вводили местно на обработанной стороне ежедневно (рис.2А). Десять дней спустя были взяты образцы кожи на спине как с мест инъекции (слева), так и с участков, не подвергавшихся лечению (справа). β-Катенин, CD133 и Ki67 окрашивали (рис. 2, от B до D) для сравнения механизма индукции волосяного фолликула DP-клетками, сфероидами DP и 5% -ным миноксидилом. Соответствующие результаты количественного анализа показаны на рис. 2 (от E до G).

    Рис. 2 Сравнение фазы волосяного фолликула с местным лечением 5% миноксидилом против инъекции 2D клеток DP или 3D сфероидов, соответственно.

    ( A ) Изображение обрабатываемой стороны (слева) и необработанной стороны (справа) мыши с депилированной кожей. ( B ) Экспрессия β-катенина после различных обработок как на обработанном участке, так и на необработанном участке. ( C ) Типичные изображения, показывающие экспрессию CD133 после различных обработок как на обработанном участке, так и на необработанном участке. ( D ) Типичные изображения, показывающие экспрессию Ki67 после различных обработок как на обработанном участке, так и на необработанном участке.Шкала 100 мкм. (От E до G ) Количественное определение β-катенин-положительных (β-катенин + ) (E), CD133 + (F) и Ki67 + (G) клеток. Розовый указывает на обработанный участок, а серый указывает на необработанный участок. n = 5; n.s., без существенной разницы; * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 и **** P <0,0001.

    Миноксидил оказывает сосудорасширяющее действие на волосяные фолликулы, приводя непосредственно к пролиферации клеток фолликулов ( 33 ).На обработанной стороне 5% миноксидил способствовал экспрессии Ki67 до 37,2% на 10 день, но не β-катенин (2,3%) или CD133 (7,2%), что позволяет предположить, что стимулировались пролиферация и рост целых клеток волосяного фолликула. неспецифически. Напротив, инъекция клеток 2D DP усиливала экспрессию β-катенина (19,1%) и CD133 (9,8%) на обработанной стороне и β-катенина (19,9%) и CD133 (6,8%) на необработанной стороне. Более того, инъекция сфероидов 3D DP увеличивала экспрессию β-катенина (32.6%) и CD133 (19,1%) на обработанной стороне и β-катенин (27,8%) и CD133 (13,7%) на необработанной стороне. Оба показали миграцию клеток на необработанном участке и повышенную экспрессию β-катенина, CD133 и Ki67 на необработанной стороне по сравнению с миноксидилом. В частности, сфероиды DP показали гораздо более сильное окрашивание β-катенина и CD133 по сравнению с группой клеток DP. Миноксидил, однако, не изменял экспрессию β-катенина или CD133 ни с одной стороны. Сигналы Ki67 на обработанной стороне были 37,2, 37,4 и 39.5% для миноксидила, клеток 2D DP и клеток 3D DP, соответственно, без существенной разницы; тем не менее, сигналы Ki67 на необработанной стороне значительно отличались: 7,1, 12,6 и 17,5% соответственно. Только группа миноксидила показала значительную разницу между обработанной и необработанной стороной. Механизм действия миноксидила не связан с непосредственной регуляцией DP-клеток, но считается, что он способствует ангиогенезу, в то время как положительные эффекты на необработанные стороны DP-клеток (в PBS или в кератине) группы, вероятно, были связаны с паракринными эффектами инъецированных DP-клеток.Инъекция кератинового гидрогеля также может способствовать привлечению эндогенного DP за счет создания биоактивного матрикса. Миграция и жизнеспособность клеток, вероятно, способствуют этому удаленному продвижению. Это исследование продемонстрировало, что имплантированные клетки не только влияют на волосяные фолликулы в месте инъекции, но также регулируют волосяные фолликулы в необработанной области. Приживление сфероидов DP было более эффективным в регулировании роста волосяных фолликулов. Кроме того, поскольку миграция клеток в коже была довольно ограниченной (рис.S4), паракринные эффекты также могут быть важным механизмом в этом процессе.

    Обработка сфероидами DP ускоряет рост волос у мышей C57BL / 6.

    Миноксидил, золотой стандарт лечения выпадения волос, был использован в качестве положительного контроля. Сообщалось, что культивируемые клетки DP постепенно теряют свою способность к индукции волос постепенно ( 4 ). Мы уже показали ограниченный терапевтический эффект введения 2D-культивированных клеток DP на рис. 2. Таким образом, здесь изучалась способность 3D-сфероидов индуцировать волосяные фолликулы.

    Мы сфотографировали состояние отрастания волос у депилированных мышей на 0, 10, 15 и 20 дни после лечения. Зону роста волос анализировали с помощью морфологического наблюдения (рис. 3, А и В). На 10 день в группах, получавших миноксидил и клетки, начала проявляться черная пигментация. У всех мышей в группе DP-сфероидов / кератина кожа была намного темнее, чем в других группах. На 15 день обработанная сторона группы миноксидила показала покрытие шерсти на 35% по сравнению с 10% на необработанной стороне.Группа сфероидов DP / PBS имела в среднем 40% -ное покрытие мехом, а покрытие мехом группы сфероидов DP / кератин составляло приблизительно 90%. Скорость приживления и выживаемости клеток в PBS была неравномерной, как и результирующие терапевтические эффекты. Напротив, кератин увеличивал общее приживление сфероидов и выживаемость клеток.

    Рис. 3. Эксперимент по росту волос на спине на мышах C57BL / 6.

    ( A ) Наблюдение за покрытием волос. Мышей разделили на пять групп ( n = 5) и лечили на их левой половине.Мышей получали изображения на 0, 10, 15 и 20 дни соответственно. ( B ) Количественная оценка покрытия волос на 10, 15 и 20 дни. Регистрировали как левый (обработанный), так и правый (необработанный) участки. n = 5; n.s., без существенной разницы; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001. Фото: S.H., Государственный университет Северной Каролины.

    Окрашивание трихромом, гематоксилином и эозином (H&E) по Массону показало, что группа лечения сфероидами DP / кератином привела к увеличению волосяных фолликулов и большему распределению коллагена по сравнению с другими группами (рис.S5, A и B). Переход покоящихся фолликулов в фазу анагена привел к увеличению размера фолликула ( 34 ). Напротив, в контрольной группе были фолликулы меньшего размера и более тонкий слой коллагена. Инъекция сфероидов DP не вызывала воспаления в ткани кожи, поскольку клетки DP были аутологичными. Кроме того, кератиновые гидрогели не вызывали острого иммунного ответа in vivo.

    Сфероиды DP ускоряют начало фазы анагена волосяного фолликула за счет активации β-катенина

    Чтобы выяснить молекулярный механизм, мы оценили уровни белка β-катенина, протеинкиназ 1 и 2, регулируемых внеклеточными сигналами (Erk 1 / 2 ), фосфо-ERK 1/2 (p-Erk 1/2 ), секретируемый белок 2 (SFRP2) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) по данным вестерн-блоттинга (рис.4, А и Б) на депилированной коже спины через 20 дней после лечения. Результаты показали, что экспрессия β-катенина и p-Erk 1/2 в группах сфероидов DP была повышена, а экспрессия SFRP2 понижена по сравнению с контрольной группой и группами миноксидила. Путь WNT / β-катенин играет решающую роль в регулировании цикла волос, способствуя росту волос ( 35 ). β-Катенин является ключевым регулятором роста волосяных фолликулов и, как сообщается, основным инициатором фазы анагена ( 36 ).Сообщалось, что SFRP2 участвует в нескольких клеточных активностях и биологических процессах посредством подавления β-катенина при ядерной транслокации. Эти результаты показывают, что сфероиды DP могут активировать развитие волосяных фолликулов за счет активации передачи сигналов β-catenin в пути WNT. Мы также выполнили иммунофлуоресцентное окрашивание SFRP2 и β-катенина (рис. 4, от C до E), чтобы дополнительно подтвердить понижающую регуляцию SFRP2 и повышающую регуляцию β-катенина в группе сфероидов / кератина. Таким образом, культура трехмерных сфероидов может быть эффективной стратегией для улучшения терапевтического действия DP перед ее применением в качестве лечения выпадения волос.

    Рис. 4 Вестерн-блоттинг и иммуногистология при различных методах лечения.

    ( A ) Вестерн-блоттинг, анализирующий содержание белков β-катенина, p-Erk 1/2 , Erk 1/2 , SFRP2 и GAPDH в коже спины на 20-й день. ( B ) Количественная оценка Уровни белка вестерн-блоттинга по группам. n = 3. ( C ) Определение стоимости иммунофлуоресценции SFRP2 и β-катенина на образцах кожи из разных групп лечения. Шкала 100 мкм.( D ) Количественная оценка относительной экспрессии SFRP2. ( E ) Количественная оценка относительной экспрессии β-катенина. n = 5. n.s., без существенной разницы; * P <0,05, ** P <0,01 и **** P <0,0001.

    Сравнение профилей белков и миРНК между клетками DP и сфероидами DP

    Сфероиды DP влияли не только на локальное место инъекции, но также на регуляцию цикла волосяных фолликулов в необработанной области за счет паракринной передачи сигналов.Клетки DP стимулируют развитие фолликулов и модулируют мезенхимно-эпителиальные взаимодействия, высвобождая различные факторы роста и экзосомы ( 24 , 37 ) (рис. 5A). Экзосомы и секретом из клеток DP и сфероидов DP были изолированы и обнаружены. По сравнению с другими лечебными группами, сфероидный секретом приводил к значительно более высоким уровням экспрессии основного фактора роста фибробластов (bFGF) и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 2 (TIMP2; фиг. S6). Изображения, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии (FEI Talos F200X), показали морфологию экзосом (рис.5Б). Средний размер экзосом, полученных из DP-клеток (DP-XOs), составлял около 180 нм, а средний размер экзосом, производных DP-сфероидов (DP spheroid-XOs) был около 130 нм (Fig. 4C). На рисунке S7 показаны идентифицирующие производители экзосом: Alix, CD9 и CD81. Чтобы сравнить содержание miRNA в экзосомах, мы выполнили массивы miRNA и обнаружили, что DP spheroid-XOs экспрессируют miR-218-5p на значительно более высоких уровнях, чем DP-XOs (Fig. 5D and Fig. S8).

    Рис. 5 Секретом из 2D клеток DP и 3D сфероидов DP.

    ( A ) Схема, иллюстрирующая, как сфероиды DP способствуют переходу цикла волос от катагена к телогену посредством миграции и секреции факторов и экзосом. В анагене обильный источник растущих клеток DP находится внутри выпуклости фолликула. ДП клетки падают во время катагена. Пополнение DP-клеток способствует наступлению анагена. (От B до E ) Характеристика 2D DP-XO и 3D DP-XO. (B) изображения ПЭМ. Экзосомы обозначены желтыми стрелками. Масштабные линейки 500 мкм.(C) Распределение по размерам с помощью NanoSight. (D) 10 лучших микроРНК с повышенной активностью и 10 отрицательной регуляции miRNA 3D DP-XO по сравнению с 2D DP-XO. ( n = 3 биологических повтора и n = 3 технических повтора для каждого биологического повтора). (E) Схема, иллюстрирующая регуляцию волосяных фолликулов, управляемую FGF2 и TIMP2, и индуцированное miR-218-5p стимулирование развития волосяных фолликулов.

    Как показано на рис. 5E, bFGF может приниматься связанным с клеточной мембраной FGFR и повышать экспрессию p-Erk 1/2 , который регулирует экспрессию β-катенина ( 38 ) .Известно, что TIMP2 ингибирует экспрессию матриксной металлопротеиназы 2 (MMP2) ( 39 ), что может препятствовать миграции и пролиферации клеток DP ( 40 ). Однако механизм, лежащий в основе MMP2-опосредованной регуляции волосяных фолликулов, все еще не ясен и требует дальнейшего изучения. Факторы роста участвуют в стимулировании циклов роста волос, и механизм bFGF был продемонстрирован ранее ( 41 , 42 ). Уровни bFGF и TIMP2 были приблизительно удвоены в секретоме сфероидов по сравнению с секретомом 2D клеток.Кроме того, miR-218-5p в 3D DP-XOs была повышена в 25 раз по сравнению с 2D DP-XOs. Таким образом, определение того, как экзосомы регулируют этот процесс, и важность miR-218-5p в опосредовании цикла роста волос были основной целью этого исследования.

    Обработка экзосом на основе сфероидов DP для возобновления роста волос

    Клеточная терапия — многообещающий шаг вперед в достижении новообразования волосяных фолликулов. Однако использование клеточных компонентов в качестве терапевтических катализаторов могло бы сделать еще более удобный терапевтический продукт, исключив клетку как терапевтический носитель.И экзосомы, и секретомы могут вносить вклад в процесс роста волос, тогда как дифференциально экспрессируемая miR-218-5p в экзосомах может вносить вклад в более высокую эффективность 3D сфероидов в стимулировании роста волос по сравнению с 2D клетками DP. Также, согласно литературе, miR-218-5p непосредственно нацелен на SFRP2 и, таким образом, он активирует путь WNT / β-catenin ( 43 ). Таким образом, активированные экзосомы miR-218-5p были основным объектом исследования в данном исследовании.

    Рекрутирование клеток DP в волосяной фолликул имеет решающее значение для возобновления роста волос ( 44 ).Мы продемонстрировали, что происходящие из сфероидов экзосомы могут эффективно способствовать миграции DP по сравнению с экзосомами из 2D-клеток (рис. S9), а повышенная подвижность клеток также может быть важна для их агрегирования и поведения миграции in vivo ( 45 ). Затем были проведены исследования in vivo на мышах C57BL / 6. Экзосомы вводили на одну сторону дорсальной кожи (фиг. 2A) и сравнивали с 5% -ным местным лечением миноксидилом. При морфологическом наблюдении (рис. 6А) и соответствующей количественной оценке (рис.6B), терапевтическая эффективность 2D DP-XO существенно не отличалась от таковой миноксидила, в то время как 3D DP spheroid-XOs ускоряли рост волос до степени, сравнимой с обработкой клетками. Чтобы изучить изменения экспрессии SFRP2 и β-катенина в коже после лечения, мы собрали образцы кожи дорсальной части из разных групп на 15-й день. Иммуноокрашивание подтвердило, что экспрессия β-катенина была увеличена в группах, получавших DP spheroid-XOs по сравнению с пациенты, получавшие 2D DP-XOs или миноксидил.DP spheroid-XOs могут регулировать циклы роста волос путем подавления SFRP2 и повышения уровня β-catenin (Fig. 6, C и D). Поскольку miR-218-5p непосредственно нацелен на SFRP2, миметики и ингибиторы miR-218-5p были использованы для дальнейшего подтверждения важности обогащения miR-218-5p.

    Рис. 6. Эффекты обработки экзосомами на рост волос на спине.

    ( A ) Мышей разделили на три группы ( n = 4) и лечили с левой стороны. Мышей снимали на 10-й и 15-й дни соответственно.( B ) Соответствующий анализ покрытия волос в разных группах. Были записаны как левая, так и правая стороны. 3D DP-XO способствовали росту волосяных фолликулов более эффективно, чем миноксидил и 2D DP-XO. n = 4; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001. ( C ) Определение стоимости иммунофлуоресценции SFRP2 (зеленый) и β-катенина (красный) на образцах кожи из разных групп лечения. Ядра окрашивали DAPI (4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол) (синий).Шкала 100 мкм. ( D ) Количественная оценка относительной экспрессии SFRP2. n = 5; **** П <0,0001. ( E ) Типичных мышей, визуализированных на 20-й день после инъекции отрицательного контроля, миметиков miR-218-5p и ингибиторов, соответственно. Красные кружки обозначают места инъекций. На месте укола есть небольшая проплешина, что означает, что способ доставки требует доработки. ( F ) Количественная оценка уровня покрытия волос (%) в трех группах на 15 день. n = 4; * P <0,05 и ** P <0,01. ( G ) активируемые экзосомы miR-218-5p и миметики miR-218-5p, доставляемые посредством in vivo-jetPEI, могут трансфицировать miR-218-5p для нацеливания на SFRP2 и, таким образом, повышать регуляцию пути WNT / β-катенина; Ингибитор miR-218-5p в определенной степени блокирует эту передачу сигналов. Фото: S.H., Государственный университет Северной Каролины.

    miR-218-5p играет решающую роль в опосредованном экзосомами возобновлении роста волос

    Одной из основных проблем при лечении miRNA является доставка.Модель in vitro не точно отражает, играет ли miR-218-5p важную роль в регуляции роста волосяных фолликулов при рассмотрении различных типов клеток в фолликулах ( 46 ). Здесь миметик mmu-miR-218-5p был смешан с раствором полиэтиленимина (PEI) (in vivo-jetPEI; Polyplus Transfection, Illkirch, France) в соответствии с инструкциями производителя. Раствор полиплекса PEI / отрицательный контроль, PEI / миметики или PEI / ингибиторы раствор полиплекса (10 мкл на участок) осторожно вводили подкожно в кожу спины депилированных мышей (рис.6E). Нацеливаясь на SFRP2, имитаторы miR-218-5p способствовали развитию волосяных фолликулов, тогда как ингибиторы miR-218-5p ингибировали начало фазы анагена в цикле волосяных фолликулов. Мы можем видеть заметные эффекты возобновления роста волос при лечении миметиком miR-218-5p по сравнению с контрольной группой и ингибиторами miR-218-5p. Однако эти эффекты (от 50 до 90% покрытия волос) были менее сильными, чем эффекты от лечения экзосомами (от 95 до 100% покрытия волос) на 20 день. Мы полагаем, что это связано с тем, что экзосомы содержат различные miRNA и белки, а miR- 218-5p — не единственный (хотя и очень важный), который способствовал росту волос.

    Мы использовали другую стратегию для стимулирования роста волос. Как показано на фиг. 6G, как загруженные miR-218-5p экзосомы, так и миметики miR-218-5p, инкапсулированные in vivo PEI, способствовали транскрипту miR-218-5p. Генетическая структура miR-218-5p показала, что он непосредственно нацелен на SFRP2. Чтобы продемонстрировать регуляторный эффект, который miR-218-5p и передача сигналов WNT оказывают на цикл роста волос, мы исследовали медиаторы транскрипции, SFRP2 и β-катенин с помощью вестерн-блоттинга. Образцы кожи (день 15) показали, что miR-218-5p имитирует устойчиво увеличенную экспрессию эндогенного β-катенина, тогда как обработка ингибиторами miR-218-5p показала снижение экспрессии β-катенина (рис.S10).

    Вместе эти данные подтверждают теорию о том, что основной терапевтический путь включает стимуляцию передачи сигналов WNT сверхэкспрессируемыми экзосомами miR-218-5p посредством подавления SFRP2, ингибитора передачи сигналов WNT, и повышения регуляции β-катенина. .

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Учитывая временную эффективность финастерида и миноксидила, а также ограниченное количество доступных методов лечения, необходимо срочно открыть новые методы лечения для предотвращения выпадения волос и ускорения их роста ( 47 ).Альтернативные решения проблематичны, особенно биопродукты.

    Пополнение DP-клеток культивированными in vitro клетками DP является разумным подходом для управления переходом телоген-анаген в цикле волосяного фолликула. Однако клетки DP со временем теряют способность вызывать образование волос, если их культивировать на плоской пластиковой поверхности. Хорн с соавторами ( 48 ) наблюдали, что культивируемые клетки DP (более шести пассажей) не могли вызвать переход волосяных фолликулов в анаген после имплантации in situ.Клетки DP должны агломерироваться в луковице волосяного фолликула, чтобы способствовать фолликулогенезу ( 49 , 50 ). Osada et al. показали, что клетки DP восстановили свою индуктивную способность волосяных фолликулов после того, как они культивировались в суспензии в виде сфероидов ( 14 ). В нашем исследовании мы подтвердили более высокую экспрессию CD133 и β-катенина в сфероидах DP по сравнению с клетками DP, что означает, что сфероиды DP могут проявлять лучшую способность к индукции роста волос in vivo.

    Секретом сфероидов DP также отличается от секрета диссоциированных клеток.Исследователи показали, что дермальные сферы морфологически сродни клеткам DP в фазе анагена с профилями экспрессии, отличными от 2D-клеток, но очень похожими на интактные клетки DP ( 51 ). Доказательств того, как пересаженные волосяные фолликулы влияют на окружающую среду в области лысины и паракринные эффекты, было недостаточно. Наши исследования продемонстрировали, что клетки DP проявляют свою регулирующую способность в отношении цикла волос в основном через паракринный механизм. Экспрессия β-катенина повышалась не только в местах инъекции, но также и в необработанных сайтах.Клетки DP выделяют различные факторы роста и везикулы для регулирования биологии фолликулов, и было установлено, что культивирование в сфероидах наиболее эффективно сохраняет исходный фенотип этих клеток in vitro. Вместо того, чтобы вводить больше клеток DP для накопления в волосяных фолликулах, вводили экзосомы для регулирования циклов волосяных фолликулов. Экзосомы, происходящие из сфероидов, с более высоким уровнем miR-218-5p по сравнению с 2D DP-XOs, также усиливали экспрессию β-катенина и подавляли SFRP2, который положительно регулировал рост волосяных фолликулов и поддерживал фазу анагена волос. цикл.

    Мыши C57BL / 6 являются полезными моделями для скрининга агентов, которые способствуют росту волос, поскольку их кожа производит пигмент только во время фазы анагена ( 52 ). Выпадение волос у человека имеет гормональные, экологические и генетические причины. Из-за своей сложности клеточная или секретомная терапия может быть более предпочтительной при лечении выпадения волос по сравнению с миноксидилом, поскольку основным терапевтическим механизмом миноксидила является усиление кожного кровотока к обрабатываемому участку. Повышенный кровоток вызывает гиперполяризацию клеточных мембран, позволяя большему количеству питательных веществ достигать фолликулов и клеток.Однако, если клетки DP остаются в спящем состоянии, вероятно, произойдет небольшое возобновление роста волос. В этом исследовании мы продемонстрировали, что сфероиды управляют циклом роста волос от телогена до анагена у здоровых мышей. Модели, связанные с заболеванием, или модели облысения, связанные с гормонами, необходимы для полной демонстрации преимуществ терапии экзосомами по сравнению с миноксидилом. Еще одно ограничение этого исследования заключается во взаимодействии экзосом с фолликулярными клетками. Мы сосредоточились на исследованиях на животных, а не на клеточных исследованиях, потому что мы не были уверены, какие типы клеток фолликулов регулируются.Для изучения механизмов в будущем необходимы дополнительные исследования клеток.

    В совокупности мы продемонстрировали, что сверхэкспрессированные miR-218-5p экзосомы ускоряют начало анагена, а культура сфероидов предоставляет потенциальные возможности для клеточной терапии. miR-218-5p регулирует развитие волосяного фолликула путем подавления ингибитора передачи сигналов WNT SFRP2, тем самым стимулируя β-катенин, создавая петлю положительной обратной связи. Наше исследование может предложить следующие преимущества по сравнению с существующей практикой регенерации волос.Для людей, не подходящих для инвазивных хирургических процедур, они могут получить пользу от введения факторов и экзосом с помощью минимально инвазивного подхода, например безыгольной инъекции ( 23 ), пластырей с микроиглами ( 53 55 ), и спреи ( 56 , 57 ). По сравнению с коммерчески доступным миноксидилом экзосомы представляют собой натуральный продукт с меньшим количеством побочных эффектов. В целом, описанные здесь исследования могут представлять новые терапевтические стратегии лечения волос.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Выделение клеток DP от мышей C57BL / 6

    Подушечки вибрисс были отрезаны от умерщвленных мышей C57BL / 6 ( 27 ), а затем промыты в PBS три раза. Волосяные фолликулы рассекали и инкубировали с 0,25% диспазой (STEMCELL Technologies) в течение 20 мин в инкубаторе. Затем над ДП был сделан горизонтальный разрез. Затем луковицы волосяных фолликулов переносили в чашку, покрытую коллагеном I (Sigma-Aldrich) из хвоста крысы. Мы использовали минимальную эссенциальную среду Игла (MEM; Gibco), 10% фетальную бычью сыворотку (FBS; Corning), 1% пенициллин-стрептомицин и bFGF (10 нг / мл; Fisher Scientific) в качестве среды DP до тех пор, пока клетки DP не вырастут из луковиц. примерно через 3 дня.Затем луковицы волосяных фолликулов промывали и помещали в свежую среду. Клетки DP достигли слияния через 1 неделю.

    Культура двумерных клеток и трехмерных сфероидов

    Для двумерных культур для пассажа использовали колбы, покрытые коллагеном I. Для этого исследования использовали пассажи с 3 по 6 клетки DP. Для 3D-культуры клетки DP высевали в 96-луночный планшет со сверхнизким прикреплением (Corning, 5 × 10 4 на лунку) для подсчета количества сфероидов. Сфероиды формировались через 2 дня после посева. В исследовании на животных использовали сфероиды с 5-го по 7-й день.

    Среду

    DP [MEM, 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицин и bFGF (10 нг / мл)] использовали для культивирования клеток. Для сбора секретома или экзосом среду DP заменяли на основную среду MEM (без FBS), как только клетки достигли 80% слияния. Затем кондиционированную среду собирали через 3 дня ( 23 ).

    Выделение и анализ секретома и экзосом

    Секретом концентрировали с помощью центробежных фильтров Amicon Ultra-15 (отсечка 3 кДа) и один раз промывали PBS. Экзосомы концентрировали с помощью центробежных фильтров Ultra-15 (отсечка 100 кДа) и один раз промывали PBS.

    Мышиный массив ангиогенеза (RayBio) и miRNA PCR (полимеразная цепная реакция) Array Mouse miFinder (Qiagen) использовали в соответствии с инструкциями производителя.

    Приготовление кератиновых гидрогелей

    Кератиновые гидрогели получали согласно предыдущей публикации с модификациями ( 6 ). Вкратце, человеческие волосы (местный парикмахер) промывали водой, а затем разрезали на мелкие кусочки. Затем фрагменты волос обрабатывали 2,5% (мас. / Об.) Перуксусной кислотой в течение ночи, а затем тщательно промывали проточной водой.Фрагменты волос погружали в 150 мМ трис-основу на 2 часа для экстракции белков. Затем после удаления волокон через сито 40 мкм получали прозрачный раствор. Этот раствор очищали диализом против деионизированной воды (с мембраной для диализа с молекулярной отсечкой 3 кДа; Fisher Scientific) и сушили вымораживанием (лиофилизировали). Полученное лиофилизированное твердое вещество дополнительно измельчали ​​в тонкий порошок. Пятнадцать процентов кератиновых гидрогелей (мас. / Об.) Получали восстановлением мелкодисперсного порошка с помощью PBS. Сфероиды диспергировали в растворе кератина и оставляли в инкубаторе при 37 ° C на ночь, пока кератин образовывал гидрогель.

    Сканирующая электронная микроскопия

    Морфологию гидрогеля визуализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Образцы фиксировали 2% глутаровым альдегидом, а затем дегидратировали в градиентном этаноле, последовательно, в течение 10 минут каждый. Затем их сушили в гексаметилдисилазане (Sigma-Aldrich). Перед визуализацией гели были покрыты золотом напылением (JEOL 6010LA SEM, JEOL Ltd., Япония).

    Животные и исследования in vivo

    Семинедельные самцы мышей C57BL / 6 были приобретены в лаборатории Джексона и им позволили адаптироваться к новой среде в течение 1 недели.Волосы удаляли с помощью крема для депиляции для наблюдения за розовой кожей ( 10 ). Затем животные были случайным образом разделены на группы ( n = 5) для изучения возобновления роста волос. Миноксидил применяли местно ежедневно в качестве положительного контроля. Все остальные виды лечения вводились подкожно. Вся работа с мышами проводилась в соответствии с Комитетом по уходу и использованию животных в Университете штата Северная Каролина.

    Доза обработки клеток: 1,0 × 10 6 клеток в 200 мкл PBS вводили подкожно в 10 пятен (20 мкл на участок) на левой стороне дорсальной кожи.

    Обработочная доза экзосом: 2,0 × 10 9 экзосом в 200 мкл PBS вводили подкожно в 10 точек (20 мкл на участок) на левой стороне кожи спины.

    Отрицательный контроль, миметики miR-218-5p и ингибиторы (Sigma-Aldrich) вводили согласно протоколу, предоставленному in vivo-jetPEI (Polyplus-transfection). Вкратце, мышам делали по 10 инъекций на каждую депилированную кожу спины. Миметик miRNA (400 нг) или ингибитор растворяли в 90 мкл 5% раствора глюкозы (мас. / об.), а затем добавляли 10 мкл раствора in vivo-jetPEI.Раствор немедленно перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре перед инъекцией. Контрольным группам вводили мимический контроль.

    Гистология кожной ткани

    Мышей умерщвляли и удаляли всю спинную кожу. Кожную ткань фиксировали в 4% параформальдегиде, а затем криостатом разрезали на срезы толщиной 5 мкм. H&E и трихром по Массону окрашивали согласно протоколам. Для гистохимии иммунофлуоресценции в качестве первичных антител использовали мышиные анти-β-катенин (Abcam, ab6301), кроличьи анти-CD133 (ab19898), кроличьи анти-Ki67 (ab16667) и кроличьи анти-SFRP2 (ab137560).В качестве вторичных антител использовали козий антимышиный иммуноглобулин G (IgG; Alexa Fluor 488; ab150113), козий антикроличий IgG (Alexa Fluor 488; ab150077) и козий антимышиный IgG (Alexa Fluor 555; ab150114).

    Вестерн-блот

    Образцы загружали и сравнивали со стандартной лестницей (Precision Plus Protein Standards, Bio-Rad). Первичные антитела были следующими: мышиный анти-β-катенин (Abcam, ab6301), кроличий SFRP2 (ab137560), анти-Erk1 (pT202 / pY204) + Erk2 (pT185 / pY187) [MAPK-YT] (ab50011), анти- ERK1 + ERK2 (ab17942) и анти-GAPDH [пероксидаза хрена (HRP)] (ab9482).Использовали козий антимышиный IgG (HRP) (ab205719) и козий антикроличий IgG (HRP) (ab205718).

    Статистический анализ

    Все количественные эксперименты проводили в трех повторностях, если не указано иное. Данные были показаны в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего и проанализированы с помощью двустороннего непарного теста Стьюдента t для сравнения между двумя группами. Сравнение данных между более чем двумя группами проводилось с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони.Данные между сгруппированными данными анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Статистически значимыми считались различия со значением P менее 0,05.

    Выражение признательности: Эта работа была частично выполнена в Центре аналитических приборов (AIF) в Университете штата Северная Каролина, который поддерживается штатом Северная Каролина и NSF (номер награды ECCS-1542015). В этой работе использовались приборы AIF, приобретенные при поддержке NSF (DMR-1726294).AIF является членом Сети нанотехнологий исследовательского треугольника Северной Каролины (RTNN), сайта в рамках Национальной скоординированной инфраструктуры нанотехнологий (NNCI). Финансирование: Эта работа финансировалась грантами NIH (R01 HL123920, HL137093, HL144002 и HL146153 для К.С.) и Американской кардиологической ассоциации (18TPA34230092 и 19EIA34660286 для К.С.). Вклад авторов: K.C. и С. разработал исследование. S.H. и З.Л. проводил эксперименты. S.H., H.L., K.H., T..S., J.C. и P.-U.C.D. проанализировал результаты и написал рукопись. J.C. закончил грамматические правки. Все авторы внесли свой вклад в общую научную интерпретацию и отредактировали рукопись. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

    Микроинкапсулированные антоцианы шелковицы способствуют усвояемости сывороточных белков in vitro в гликозилированных моделях энергетических шариков.

    Основные моменты

    Антоцианы шелковицы фактически способствовали перевариванию энергетических шариков после хранения.

    Антоцианы шелковицы частично раскрывают вторичную структуру сывороточных белков.

    Нековалентное связывание произошло между антоцианом шелковицы и сывороточным протеином.

    Abstract

    Изучено влияние антоцианов шелковицы (МА) на усвояемость сывороточных белков (WP) в свежеприготовленных и сохраненных энергетических шарах. Результаты показали, что МА увеличивают перевариваемость энергетических шаров за счет увеличения степени их гидролиза, фракций растворимых пептидов и уменьшения размера их частиц и агломерации. Поэтому, чтобы понять механизм стимулирования и / или ингибирования пищеварительных эффектов МА, были измерены вторичные структурные изменения и связывание смесей WP-MA.Результаты показали, что МА могут нековалентно / ковалентно взаимодействовать с WP и образовывать WP-MA-аддукты. Это взаимодействие, по-видимому, отвечало за изменения во вторичной структуре WP, которые впоследствии могли способствовать усвояемости энергетических шаров. МА также частично разворачивали структуру переваренных WP посредством колебания их α-спирали и β-листа. Был сделан вывод, что разворачивание WP-структуры, индуцированное взаимодействиями МА, может увеличить доступность пептидных связей для пищеварительных ферментов и, как следствие, облегчить перевариваемость белка в энергетических шарах.

    Сокращения

    MD

    Молекулярно-динамическое моделирование

    MALDI-TOF-MS

    Тандемная времяпролетная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией и ионизацией

    Расщепление in vitro

    Характеристики переваренного пептида

    Связывание сывороточного протеина с антоцианом

    Изменения вторичной структуры

    Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

    Полный текст

    © 2020 Elsevier Ltd.Все права защищены.

    Рекомендуемые статьи

    Ссылки на статьи

    О продвижении использования не по назначению | Закон о лекарствах и устройствах

    Мы публиковали больше раз, чем мы можем рассчитывать, в поддержку позиции, что производители, регулируемые FDA, должны иметь возможность участвовать в правдивой «рекламе» использования своих продуктов не по назначению. Итак, по общенациональному телевидению — и в присутствии комиссара FDA — 19 марта 2010 г. президент Соединенных Штатов выступил с заявлением о том, что лекарство, отпускаемое по рецепту, гидроксихлорохина сульфат (фирменное наименование: Плаквенил), не по назначению. COVID-19. См. Видео на 12: 18-14: 56. Мы не будем заходить так далеко, чтобы называть продвижение «правдивым», потому что мы, откровенно говоря, не знаем, и президент сделал множество других заявлений на пресс-конференциях, которые позже были прояснены, уточнены, отклонены или иным образом изменены в ближайшее время. потом его официальными лицами.

    Действительно, FDA разъяснило, что любое предположение о том, что гидроксихлорохин был одобрен для лечения COVID-19, было ложным, хотя оно пообещало продолжить рассмотрение этого и других препаратов в качестве возможных методов лечения COVID-19.В другом месте эксперты в области здравоохранения широко заявляли, что, несмотря на некоторые интересные результаты in vitro , нет никаких доказательств того, что этот препарат (который имеет значительные риски, включая опасные для жизни сердечно-сосудистые расстройства) имеет клинически значимое различие в качестве противовирусного средства в любом из них. животные или люди.

    Hydroxychloroquine существует уже давно, и в настоящее время почти полностью универсален, но его одобренная FDA маркировка имеет только одно предполагаемое использование:

    ПОКАЗАНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

    Малярия

    ПЛАКВЕНИЛ показан для лечения неосложненной малярии, вызванной P.falciparum, P. malariae, P. ovale и P. vivax.

    ПЛАКВЕНИЛ показан для профилактики малярии в географических районах, где не сообщается о резистентности к хлорохину.

    Маркировка FDA на второй-третьей ненумерованной странице.

    FDA не регулирует терапевтическое использование одобренных лекарств (и медицинских устройств) для состояний, отличных от тех, для которых такие лекарства отмечены. «Использование маркировки [O] ff является общепринятым» в соответствии с законом как «необходимое следствие миссии FDA по регулированию в этой области без прямого вмешательства в медицинскую практику.” Buckman Co. против Юридического комитета истцов , 531 U.S. 341, 350 (2001). Таким образом, «врачи могут прописывать лекарства и устройства для использования не по назначению». ид. , стр. 351 и № 5. Действительно, в другом месте того же пресс-релиза FDA также заявило:

    Распространение информации о многообещающих применениях лекарств не по назначению, которые у нас уже есть, исследование их эффективности и поиск других терапевтических средств поможет американским поставщикам медицинских услуг инструменты, необходимые для спасения жизней.

    Мы действительно согласны с президентом, что является редким случаем, что текущие ограничения FDA на правдивую рекламу вне лейбла являются «устаревшими правилами» (видео на 9: 16-: 18) и создают «ненужные» барьеры (видео на 9: 29- : 32) к передаче медицинской информации.

    Другой препарат, ремдесивир, также упоминался (видео, 14: 46-15: 50) как предположительно «одобренный по существу».

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *