Оценка признаков, способствующих росту растений, при индивидуальной обработке выбранных изолятов ризобактерий чая на сеянцах риса сорта IR64. Пятидневные проростки обрабатывали отдельными изолятами ризобактерий, и параметры роста, такие как ( a ) влажная масса, ( b ) сухая масса, ( c ) длина корней и ( d ) длина побегов были измеряется через 21 день после лечения.Двусторонний t-критерий определил уровень значимости, а данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. ( a : значение P-0,05–0,01, b : значение P 0,01–0,001 и c : значение P менее 0,001).

Оценка концентрации хлорофилла при индивидуальной обработке выбранных изолятов ризобактерий чая на проростках риса сорта IR64. Пятидневные проростки обрабатывали отдельными изолятами ризобактерий, и через 21 день после обработки измеряли общую концентрацию хлорофилла.Двусторонний t-критерий определил уровень значимости, а данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. (a: значение P-0,05–0,01, b: значение P 0,01–0,001 и c: значение P менее 0,001).

Влияние обработки PGPR на связанные с защитой ферменты в рисе

Ризобактерии, способствующие росту растений (PGPR), как известно, придают растениям индуцированную системную устойчивость (ISR) к бактериальным, грибковым и вирусным заболеваниям ⁶⁴ . Было показано, что они вызывают системную защиту растений от патогенов листьев и корней ^65,66 .Предыдущие исследования показали, что различные штаммы PGPR защищают растения от различных патогенов, активируя гены защиты растений, кодирующие хитиназу, β-1,3-глюканазу, PAL (фенилаланинаммиаклиазу), CAT (каталазу), APX (аскорбатпероксидазу), POD (пероксидазу). ) и другие ферменты, многие из которых действуют как поглотители первичных активных форм кислорода (АФК) ⁶⁷ . В настоящем исследовании мы изучили статус активности APX, CAT, хитиназы и PAL в растениях риса, обработанных PGPR (рис.5 и рис. S3).

Влияние обработки ризобактериями на ( a ) аскорбатпероксидазу (APX), ( b ) каталазу (CAT), ( c ) хитиназу и ( d ) фенилаланин-аммиак-лиазу ( PAL) в побеговой фракции проростков риса сорта IR64. Пятидневные проростки риса обрабатывали отдельными изолятами ризобактерий, и через 14 дней после обработки измеряли ферменты антиоксидантной защиты в препарате лизата побегов.Двусторонний t-критерий определил уровень значимости, а данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. (a: значение P-0,05–0,01, b: значение P 0,01–0,001 и c: значение P менее 0,001).

Фермент аскорбатпероксидаза детоксифицирует H ₂ O ₂ , образующийся как побочный продукт антиоксидантных механизмов, и превращает его в воду в хлоропласте, цитоплазме и митохондриях ^9,68 . Предполагается, что повышенная активность APX вносит вклад в детоксикацию увеличенного накопления H ₂ O ₂ в клетках ⁶³ .Растения, инокулированные изолятами ризобактерий чая, показали различную активность APX в побегах и корнях соответственно. В лизате побегов активность APX была значительно увеличена у растений, обработанных 12 изолятами ризобактерий (40%) (P ≤ 0,05–0,001) (рис. 5а). В случае изолятов AB237, AB242 и AB285 активность APX в лизате побегов оказалась максимальной среди обработанных растений (P ≤ 0,001) (рис. 5а). В случае корневого лизата значительное усиление активности APX было очевидно для 13 изолятов ризобактерий (43.3%) (P ≤ 0,05–0,001) (рис. S3a). Было обнаружено, что обработка изолятами AB212, AB236, AB246 и AB255 показывала максимальную активность APX в лизатах корней обработанных растений (P ≤ 0,001) (рис. S3a). Вместе измерения активности APX показали, что около 40% и 43,3% изолятов ризобактерий показали статистически значимое усиление активности APX в побегах и / или корнях обработанных растений.

Каталаза (CAT) действует как клеточный поглотитель H ₂ O ₂ и катализирует его диспропорционирование в H ₂ O и O ₂ ⁶⁹ .Из 30 изолятов ризобактерий 16 (53,3%) показали статистически значимое повышение активности CAT в лизатах побегов растений по сравнению с необработанным контролем (P ≤ 0,05–0,001) (рис. 5b). Было обнаружено, что среди этих изолятов AB201 и AB237 индуцируют максимальную активность CAT в побегах растений (P ≤ 0,001) (рис. 5b). В то время как в лизатах корней активность CAT была значительно выше у растений, обработанных 14 изолятами ризобактерий (46,6%) (P ≤ 0,05–0,001) (рис. S3b).Среди этих изолятов обработка AB237 показала максимальное увеличение активности CAT в корнях растений (P ≤ 0,001) (рис. S3b). В совокупности было обнаружено, что активность CAT значительно увеличивалась в побегах и корнях обработанных растений при обработке примерно 53,3% и 46,6% изолятов ризобактерий.

Хитиназы входят в состав белков, связанных с патогенами растений. Эти ферменты сильно индуцируются, когда растение заражено грибковым патогеном или из-за стимуляции индуцированной системной устойчивости (ISR) в результате взаимодействия PGPR-растение ^5,70 .Хитиназы действуют как важный арсенал для смягчения грибковой инфекции у растений путем прямого литического действия на клеточные стенки грибов или путем стимуляции различных защитных механизмов растений путем высвобождения сигнальных молекул олигосахаридов ⁷⁰ . Среди отобранных ризобактерий 19 изолятов (63,3%) показали значительное увеличение активности хитиназы в побегах обработанных растений риса (P ≤ 0,05–0,001) (рис. 5c). Обработка изолятами AB214 и AB285 приводила к статистически наиболее значительному увеличению активности хитиназы (P ≤ 0.001) (рис. 5в). В отличие от побегов, лизаты корней обработанных растений показали значительное повышение активности хитиназы при обработке 15 изолятами ризобактерий (50%) (P ≤ 0,05–0,001) (рис. S3c). Кроме того, обработка AB228 и AB233 показала максимальную индукцию активности хитиназы в корне обработанных растений (P ≤ 0,001) (рис. S3c). В целом, при обработке примерно 63,3% и 50% изолятов ризобактерий было очевидно значительное увеличение активности хитиназы в побегах и корнях обработанных растений.

Фенилаланин-аммиачная лиаза (PAL) — важный фермент, который помогает растениям смягчать различные стрессовые условия. ^5,67 . PAL предлагает физиологическую и структурную поддержку растений, превращая L-фенилаланин в аммиак и транс-коричную кислоту. Было показано, что обработка риса микробами увеличивает активность PAL и накопление полифенолов в листьях и тем самым помогает улучшить стрессовые условия (засуха, засоление и т. Д.). ⁶⁷ . В настоящем исследовании мы наблюдали, что в большинстве случаев обработка ризобактериями приводила к усилению активности фермента PAL в лизатах побегов риса.В случае 26 изолятов ризобактерий (86,6%) статистически значимое увеличение активности PAL было отмечено для образцов побегов обработанных растений риса (P ≤ 0,05–0,001) (рис. 5d). Однако наиболее значительная активность PAL была зарегистрирована в образцах побегов растений, обработанных изолятами AB228, AB267, AB276 и AB336 (P ≤ 0,001) (рис. 5d). В образцах корней было обнаружено, что активность PAL увеличивалась при обработке 16 изолятами ризобактерий (53,3%) (P ≤ 0,05–0,001) (рис. S3d). Из изолятов ризобактерий обработка AB267 и AB341 показала максимальную активность PAL в образцах корней обработанных растений (P ≤ 0.001) (Рис. S3d). В совокупности наш анализ показал, что около 86,6% изолятов ризобактерий увеличивают активность PAL в областях побегов, в то время как только 53,3% изолятов могут способствовать активности PAL в области корней обработанных растений риса.

В конце концов, повышенная активность связанных с защитой ферментов, таких как APX, CAT, хитиназа и PAL, в обработанных PGPR растениях риса привело нас к предположению, что (i) обработка ризобактериями может стимулировать индуцированную системную резистентность (ISR), a состояние повышенной защитной способности растений риса, и (ii) изоляты ризобактерий способны модулировать активность ферментов, связанных с защитой, и тем самым помогают растению подготовиться к будущим испытаниям с биотическими и абиотическими стрессами.Доступна ограниченная информация о том, как PGPR из ризосферы чая модулируют защитные пути в растениях-хозяевах ^17,71 . Насколько нам известно, это, возможно, первое сообщение о модуляции активности ферментов, связанных с защитой, PGPR чая параллельно с их типичными свойствами, способствующими росту растений.

Накопление пролина и полифенолов в инокулированных растениях риса

АФК, поглощая небольшие метаболиты, такие как каротиноиды, фенолы, пролин и токоферол, поддерживают окислительно-восстановительный баланс в клетках во время окислительного повреждения ⁷² .Обработка PGPR увеличивает концентрацию пролина и полифенолов, что обычно способствует улавливанию ROS в растениях ⁷³ . В настоящем исследовании мы измерили концентрацию пролина и полифенолов в обработанных растениях риса.

Пролин — отличный осмолит, который помогает в стабилизации субклеточных макромолекул, таких как белки и клеточные мембраны. Кроме того, он участвует в улавливании свободных радикалов, балансировании окислительно-восстановительного гомеостаза и передачи сигналов, тем самым помогая растениям справляться со стрессовыми условиями ⁷⁴ .Было обнаружено, что 18 изолятов ризобактерий (60%) вызывают статистически значимое увеличение концентрации пролина в образцах побегов обработанного риса по сравнению с необработанными контрольными растениями (P ≤ 0,05–0,001) (рис. 6a). Изоляты AB321 вызывали наиболее значительное увеличение концентрации пролина в побегах обработанных растений риса (P ≤ 0,001) (рис. 6а). В случае того же набора обработок анализ образцов корней показал, что 14 изолятов ризобактерий (46,6%) вызвали статистически значимое увеличение содержания пролина (P ≤ 0.05–0.001), причем изолят AB228 является наиболее эффективным (P ≤ 0.001) (рис. 6б). В совокупности оценки пролина в растениях риса, обработанных ризобактериями, показали, что в большинстве обработок концентрация пролина была увеличена в образцах побегов (60%), а также в образцах корней (46,6%), что указывает на возможное праймирование (как местное, так и системное) с помощью PGPR. растениям предстоит столкнуться с будущими проблемами биотических и абиотических стрессов.

Влияние обработки ризобактериями на ( a ) содержание пролина в побегах и ( b ) содержание пролина в корнях в проростках риса сорта IR64.Пятидневные проростки риса обрабатывали отдельными изолятами ризобактерий и измеряли молекулы антиоксидантной защиты через 14 дней после обработки. Двусторонний t-критерий определил уровень значимости, а данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. (a: значение P-0,05–0,01, b: значение P 0,01–0,001 и c: значение P менее 0,001).

Показано, что накопление полифенолов в листьях растений играет защитную роль против биотических и абиотических стрессов за счет антиокисления и дезактивации АФК ⁶⁷ .Обработка микробами влияет на накопление полифенолов в листьях растений ⁷⁵ . Являясь мощным антиоксидантом, высокое накопление полифенолов в листьях должно усиливать стрессоустойчивость растений. ⁷⁵ . В настоящем исследовании мы измерили общее накопление полифенолов в обработанных растениях риса. Наш анализ показал, что при обработке 23 изолятами ризобактерий (76,6%) в листьях наблюдалось статистически значимое увеличение общего количества полифенолов (P ≤ 0.05–0.001) (рис. 7). Однако обработка изолятами AB304 вызвала наиболее значительный эффект с точки зрения измерения общих полифенолов в листьях (P ≤ 0,001) (рис. 7). В совокупности накопление полифенолов наблюдалось в большинстве обработок (76,6%), что указывает на возможное усиление антиоксидантов в растениях.

Влияние обработки ризобактериями на накопление общего количества полифенолов в проростках риса сорта IR64. Пятидневные проростки риса обрабатывали отдельными изолятами ризобактерий и измеряли молекулы антиоксидантной защиты через 14 дней после обработки.Двусторонний t-критерий определил уровень значимости, а данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. (a: значение P-0,05–0,01, b: значение P 0,01–0,001 и c: значение P менее 0,001).

Повышенная устойчивость растений риса, предварительно обработанных PGPR, к инфекции кожного ожога

Кожные экзосомы, содержащие miR-218-5p, способствуют регенерации волос, регулируя передачу сигналов β-катенина

ВВЕДЕНИЕ

Люди, страдающие умеренным выпадением волос, обращаются к местным препаратам, таким как миноксидил (антигипертензивное средство, открывающее калиевые каналы) ( 1 ) и финастерид (дигидротестостерон). -подавляющий ингибитор 5α-редуктазы) ( 2 ), единственное одобренное Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов средство для стимуляции роста волос.Оба предназначены не для лечения выпадения волос, а для лечения интуиции. Исследователи продолжали изучать механизм циклов волосяных фолликулов и разрабатывать маломолекулярные препараты ( 3 — 5 ), биопродукты ( 6 ), составы ( 7 , 8 ), лазерную терапию ( 9 ), и хирургическое лечение ( 10 ), поскольку ни миноксидил, ни финастерид не очень эффективны. Миноксидил и финастерид требуют постоянного повторного нанесения пользователем для поддержания роста волос ( 7 ).В своих попытках понять, как отрастают волосы, многие исследователи искали более эффективный подход, сосредоточив внимание на цикле волосяных фолликулов. Они пытались стимулировать прогрессирование фолликулов из фазы покоя (телоген) в активную фазу (анаген) ( 8 ). Вместо трансплантации фолликулярных единиц, которая является дорогостоящей и иногда сталкивается с нехваткой донорских волосяных фолликулов, исследователи попытались использовать клеточную терапию для лечения выпадения волос путем культивирования и размножения клеток волосяных фолликулов или мезенхимальных клеток in vitro, а затем имплантации их в лысину. .В фазе анагена область выпуклости волосяного фолликула является обильным источником активно растущих клеток дермального сосочка (DP), которые выпадают во время фазы покоя. Было высказано предположение, что волосяные фолликулы на лысых участках не исчезают, а уменьшаются в размерах ( 11 ). Пополнение DP-клетками лысых участков, таким образом, является вероятным способом вызвать фазовый переход телоген-анаген, необходимый для индукции роста волос.

Взаимодействия между эпителиальными и мезенхимальными клетками жизненно важны для регулирования цикла роста волос ( 12 ).В качестве основного мезенхимального компонента фолликулярной единицы клетки DP вызывают переход от телогена к анагену и образование новых фолликулов. Таким образом, регулирование клеток DP имеет решающее значение для увеличения скорости деления клеток и роста фолликулов. Двумерные (2D) культивированные клетки DP не продемонстрировали терапевтического эффекта на рост волосяных фолликулов ( 13 ). Сообщалось, что культуры трехмерных сфероидов приводят к частичному восстановлению индуктивных способностей клеток DP, что может позволить им индуцировать de novo волосяные фолликулы в коже человека ( 13 ).DP-клетки должны агрегироваться в областях волосяных фолликулов, чтобы быть эффективными ( 14 ). Таким образом, терапия с использованием сфероидальных культур должна быть эффективным способом восстановления способности волос к регенерации in vitro. Однако требуется всестороннее понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе этого регенеративного процесса. Клетки DP вызывают развитие цикла и регенерацию волос, что требует взаимодействия с окружающей средой ( 15 ). Экзосомы широко исследовались из-за их роли в межклеточной коммуникации и потенциала в лечении заболеваний ( 16 — 18 ).Дифференциально экспрессируемый секретом или экзосомы из сфероидов DP и клеток DP могут быть ключом к регулированию циклов волосяных фолликулов. Недавно секретом клеток DP и внеклеточные везикулы ( 8 , 19 , 20 ) продемонстрировали свой эффект в стимулировании роста волос, и их механизм находится в стадии обширных исследований. По сравнению с экзосомами, полученными из мезенхимальных стволовых клеток ( 8 , 21 ), экзосомы, полученные из DP-клеток, оказались эффективными активаторами трансформирующего фактора роста β и оказались важными для стимулирования пролиферации DP-клеток волосяных фолликулов человека и волос рост ( 22 ).Было доказано, что 3D-культура является способом обогащения определенных белков и микроРНК (miRNA) в секретоме ( 23 ). Молодые и соавторы ( 24 ) продемонстрировали, что экзосомы, полученные из клеток 3D DP (3D DP-XOs), способствовали пролиферации клеток DP и клеток оболочки наружного корня и увеличивали экспрессию факторов роста в клетках DP. Однако важность дифференциально экспрессируемого секретома и miRNAs из 2D DP клеток и 3D DP клеток и возможных механизмов 3D DP клеток или 3D DP-XOs в стимулировании регенерации волос не была продемонстрирована.В этом исследовании мы впервые проверили способность сфероидов DP к восстановлению волос у мышей C57BL / 6. Затем терапевтическая эффективность секретома DP сравнивалась с терапевтической эффективностью сфероидов DP. При агрегации клеток DP экспрессируются разные факторы и экзосомы. Принимая во внимание агрегативное поведение клеток DP и способность сфероидов DP индуцировать образование новых волосяных фолликулов in vivo, мы предположили, что дифференциально экспрессируемые факторы и miRNA будут ранее неопределенными терапевтическими средствами для возобновления роста волос.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сфероиды DP усиливают экспрессию β-катенина и CD133 in vitro и приживление трансплантата in vivo

Мыши C57BL / 6 широко используются в исследованиях физиологии волос, потому что после депиляции их спины все волосяные фолликулы в этой области переходят в фазу паузы (катаген), когда мыши достигают возраста 7 недель ( 25 , 26 ). Клетки DP выделяли из усов мышей C57BL / 6 ( 27 ) и культивировали. В этом исследовании использовались отрывки с 3 по 6.На рисунке 1А показано, что клетки DP выросли из луковицы волосяного фолликула и имели веретенообразную форму, когда они образовывали спирально-параллельные массивы с центром в луковице. После пассажа клетки DP имели уплощенную многоугольную морфологию (рис. 1B). Сфероиды DP были сформированы путем пассирования клеток DP в колбы сверхнизкого прикрепления. Сфероиды имели диаметр от 150 до 300 мкм (фиг. 1C и фиг. S1) и выражали сильные иммунофлуоресцентные сигналы CD133 (зеленый) и β-катенина (красный; фиг. 1D). Экспрессия CD133 и β-катенина была ниже в 2D культивируемых клетках DP (рис.S2). У сфероидов экспрессия β-катенина была усилена из-за увеличения межклеточного контакта ( 13 ). CD133-положительные клетки DP проявляли способность индуцировать волосы in vivo ( 28 ). Это было дополнительно подтверждено с помощью проточной цитометрии. Повышенную интенсивность сигнала можно увидеть в закрытых сфероидных клетках (рис. S3).

( A ) Выделение клеток дермального сосочка (DP) мыши из вибрисс.Масштабная линейка 500 мкм. ( B ) Обычная культура позволяет выращивать 2D-клетки DP. Масштабная линейка, 50 мкм. ( C ) Рост сфероидов DP в колбах для сверхнизких культур клеток. Шкала 100 мкм. ( D ) Двойное окрашивание на CD133 (зеленый) и β-катенин (красный) в сфероидах. Шкала 100 мкм. ( E и F ) Изображения кератина (E) и трехмерного кератина, нагруженного сфероидом, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). (F) Один очевидный сфероид выделен желтым цветом. Шкала 100 мкм.( G ) Схема, иллюстрирующая места инъекции на спине мыши для исследования удержания клеток. ( H ) Мыши брили и вводили на кожу спины различные составы, как показано на (G). Клетки метили с помощью DiD, а затем ресуспендировали в PBS или кератине для внутрикожной инъекции. Изображения системы визуализации in vivo (IVIS) были получены в разные моменты времени. ( I ) Количественная оценка изображений IVIS. Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение, n = 3 мыши.Трехмерные сфероиды / кератин показали самое продолжительное время удерживания.

Для сравнения выживаемости клеток после трансплантации, клетки DP и сфероиды DP, окрашенные DiD (1,1′-диоктадецил-3,3,3 ‘, 3’-тетраметилиндодикарбоцианин, 4-хлорбензолсульфонатная соль), вводили в депилированные спины C57BL / 6 мышей. Каркасы играют важную роль в трехмерной культуре клеток и инженерии ( 29 ). Кератины волос были использованы в качестве каркасов для клеточных культур ( 8 , 30 ), поскольку они аутологичны, разлагаются и биосовместимы.Жизнеспособность клеток DP сохранялась во время инкапсуляции и сохранялась в пористой микроархитектуре кератиновых гидрогелей. Сети кератиновых гидрогелей и сфероидов, самоорганизующихся внутри гидрогелей, показаны на рис. 1 (E и F) соответственно. 2D-клетки или 3D-сфероиды собирали и распределяли в фосфатно-солевом буфере (PBS) или кератиновом гидрогеле (10 ⁵ клеток / 20 мкл) для подкожного введения. Чтобы улучшить выживаемость клеток после трансплантации, мы сравнили клетки DP / PBS, клетки DP / кератин, сфероиды DP / PBS и сфероиды DP / кератин (рис.1G). Визуализация IVIS (система визуализации in vivo) показала, что сфероиды демонстрируют повышенную задержку и выживаемость после инъекции (рис. 1, H и I). Сфероиды обеспечивают более высокую частоту трансплантации и функциональную выгоду ( 31 , 32 ). Кератин также поддерживает прикрепление и пролиферацию клеток ( 8 ). Сфероиды DP / кератиновый гидрогель сохраняли высокую жизнеспособность клеток после приживления на спинной коже мышей.

сфероидов DP усиливают экспрессию β-катенина, CD133 и Ki67 в волосяных фолликулах in vivo.

Клетки DP и сфероиды DP вводили в одну сторону каждой мыши после депиляции (10 одноразовых инъекций, равномерно распределенных по обработанным сторона, 10 ⁵ клеток в 20 мкл на инъекцию), или 5% миноксидил вводили местно на обработанной стороне ежедневно (рис.2А). Десять дней спустя были взяты образцы кожи на спине как с мест инъекции (слева), так и с участков, не подвергавшихся лечению (справа). β-Катенин, CD133 и Ki67 окрашивали (рис. 2, от B до D) для сравнения механизма индукции волосяного фолликула DP-клетками, сфероидами DP и 5% -ным миноксидилом. Соответствующие результаты количественного анализа показаны на рис. 2 (от E до G).

( A ) Изображение обрабатываемой стороны (слева) и необработанной стороны (справа) мыши с депилированной кожей. ( B ) Экспрессия β-катенина после различных обработок как на обработанном участке, так и на необработанном участке. ( C ) Типичные изображения, показывающие экспрессию CD133 после различных обработок как на обработанном участке, так и на необработанном участке. ( D ) Типичные изображения, показывающие экспрессию Ki67 после различных обработок как на обработанном участке, так и на необработанном участке.Шкала 100 мкм. (От E до G ) Количественное определение β-катенин-положительных (β-катенин ⁺ ) (E), CD133 ⁺ (F) и Ki67 ⁺ (G) клеток. Розовый указывает на обработанный участок, а серый указывает на необработанный участок. n = 5; n.s., без существенной разницы; * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 и **** P <0,0001.

Миноксидил оказывает сосудорасширяющее действие на волосяные фолликулы, приводя непосредственно к пролиферации клеток фолликулов ( 33 ).На обработанной стороне 5% миноксидил способствовал экспрессии Ki67 до 37,2% на 10 день, но не β-катенин (2,3%) или CD133 (7,2%), что позволяет предположить, что стимулировались пролиферация и рост целых клеток волосяного фолликула. неспецифически. Напротив, инъекция клеток 2D DP усиливала экспрессию β-катенина (19,1%) и CD133 (9,8%) на обработанной стороне и β-катенина (19,9%) и CD133 (6,8%) на необработанной стороне. Более того, инъекция сфероидов 3D DP увеличивала экспрессию β-катенина (32.6%) и CD133 (19,1%) на обработанной стороне и β-катенин (27,8%) и CD133 (13,7%) на необработанной стороне. Оба показали миграцию клеток на необработанном участке и повышенную экспрессию β-катенина, CD133 и Ki67 на необработанной стороне по сравнению с миноксидилом. В частности, сфероиды DP показали гораздо более сильное окрашивание β-катенина и CD133 по сравнению с группой клеток DP. Миноксидил, однако, не изменял экспрессию β-катенина или CD133 ни с одной стороны. Сигналы Ki67 на обработанной стороне были 37,2, 37,4 и 39.5% для миноксидила, клеток 2D DP и клеток 3D DP, соответственно, без существенной разницы; тем не менее, сигналы Ki67 на необработанной стороне значительно отличались: 7,1, 12,6 и 17,5% соответственно. Только группа миноксидила показала значительную разницу между обработанной и необработанной стороной. Механизм действия миноксидила не связан с непосредственной регуляцией DP-клеток, но считается, что он способствует ангиогенезу, в то время как положительные эффекты на необработанные стороны DP-клеток (в PBS или в кератине) группы, вероятно, были связаны с паракринными эффектами инъецированных DP-клеток.Инъекция кератинового гидрогеля также может способствовать привлечению эндогенного DP за счет создания биоактивного матрикса. Миграция и жизнеспособность клеток, вероятно, способствуют этому удаленному продвижению. Это исследование продемонстрировало, что имплантированные клетки не только влияют на волосяные фолликулы в месте инъекции, но также регулируют волосяные фолликулы в необработанной области. Приживление сфероидов DP было более эффективным в регулировании роста волосяных фолликулов. Кроме того, поскольку миграция клеток в коже была довольно ограниченной (рис.S4), паракринные эффекты также могут быть важным механизмом в этом процессе.

Обработка сфероидами DP ускоряет рост волос у мышей C57BL / 6.

Миноксидил, золотой стандарт лечения выпадения волос, был использован в качестве положительного контроля. Сообщалось, что культивируемые клетки DP постепенно теряют свою способность к индукции волос постепенно ( 4 ). Мы уже показали ограниченный терапевтический эффект введения 2D-культивированных клеток DP на рис. 2. Таким образом, здесь изучалась способность 3D-сфероидов индуцировать волосяные фолликулы.

Мы сфотографировали состояние отрастания волос у депилированных мышей на 0, 10, 15 и 20 дни после лечения. Зону роста волос анализировали с помощью морфологического наблюдения (рис. 3, А и В). На 10 день в группах, получавших миноксидил и клетки, начала проявляться черная пигментация. У всех мышей в группе DP-сфероидов / кератина кожа была намного темнее, чем в других группах. На 15 день обработанная сторона группы миноксидила показала покрытие шерсти на 35% по сравнению с 10% на необработанной стороне.Группа сфероидов DP / PBS имела в среднем 40% -ное покрытие мехом, а покрытие мехом группы сфероидов DP / кератин составляло приблизительно 90%. Скорость приживления и выживаемости клеток в PBS была неравномерной, как и результирующие терапевтические эффекты. Напротив, кератин увеличивал общее приживление сфероидов и выживаемость клеток.

( A ) Наблюдение за покрытием волос. Мышей разделили на пять групп ( n = 5) и лечили на их левой половине.Мышей получали изображения на 0, 10, 15 и 20 дни соответственно. ( B ) Количественная оценка покрытия волос на 10, 15 и 20 дни. Регистрировали как левый (обработанный), так и правый (необработанный) участки. n = 5; n.s., без существенной разницы; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001. Фото: S.H., Государственный университет Северной Каролины.

Окрашивание трихромом, гематоксилином и эозином (H&E) по Массону показало, что группа лечения сфероидами DP / кератином привела к увеличению волосяных фолликулов и большему распределению коллагена по сравнению с другими группами (рис.S5, A и B). Переход покоящихся фолликулов в фазу анагена привел к увеличению размера фолликула ( 34 ). Напротив, в контрольной группе были фолликулы меньшего размера и более тонкий слой коллагена. Инъекция сфероидов DP не вызывала воспаления в ткани кожи, поскольку клетки DP были аутологичными. Кроме того, кератиновые гидрогели не вызывали острого иммунного ответа in vivo.

Сфероиды DP ускоряют начало фазы анагена волосяного фолликула за счет активации β-катенина

Чтобы выяснить молекулярный механизм, мы оценили уровни белка β-катенина, протеинкиназ 1 и 2, регулируемых внеклеточными сигналами (Erk ^{1 / 2} ), фосфо-ERK ^1/2 (p-Erk ^1/2 ), секретируемый белок 2 (SFRP2) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) по данным вестерн-блоттинга (рис.4, А и Б) на депилированной коже спины через 20 дней после лечения. Результаты показали, что экспрессия β-катенина и p-Erk ^1/2 в группах сфероидов DP была повышена, а экспрессия SFRP2 понижена по сравнению с контрольной группой и группами миноксидила. Путь WNT / β-катенин играет решающую роль в регулировании цикла волос, способствуя росту волос ( 35 ). β-Катенин является ключевым регулятором роста волосяных фолликулов и, как сообщается, основным инициатором фазы анагена ( 36 ).Сообщалось, что SFRP2 участвует в нескольких клеточных активностях и биологических процессах посредством подавления β-катенина при ядерной транслокации. Эти результаты показывают, что сфероиды DP могут активировать развитие волосяных фолликулов за счет активации передачи сигналов β-catenin в пути WNT. Мы также выполнили иммунофлуоресцентное окрашивание SFRP2 и β-катенина (рис. 4, от C до E), чтобы дополнительно подтвердить понижающую регуляцию SFRP2 и повышающую регуляцию β-катенина в группе сфероидов / кератина. Таким образом, культура трехмерных сфероидов может быть эффективной стратегией для улучшения терапевтического действия DP перед ее применением в качестве лечения выпадения волос.

( A ) Вестерн-блоттинг, анализирующий содержание белков β-катенина, p-Erk ^1/2 , Erk ^1/2 , SFRP2 и GAPDH в коже спины на 20-й день. ( B ) Количественная оценка Уровни белка вестерн-блоттинга по группам. n = 3. ( C ) Определение стоимости иммунофлуоресценции SFRP2 и β-катенина на образцах кожи из разных групп лечения. Шкала 100 мкм.( D ) Количественная оценка относительной экспрессии SFRP2. ( E ) Количественная оценка относительной экспрессии β-катенина. n = 5. n.s., без существенной разницы; * P <0,05, ** P <0,01 и **** P <0,0001.

Сравнение профилей белков и миРНК между клетками DP и сфероидами DP

Сфероиды DP влияли не только на локальное место инъекции, но также на регуляцию цикла волосяных фолликулов в необработанной области за счет паракринной передачи сигналов.Клетки DP стимулируют развитие фолликулов и модулируют мезенхимно-эпителиальные взаимодействия, высвобождая различные факторы роста и экзосомы ( 24 , 37 ) (рис. 5A). Экзосомы и секретом из клеток DP и сфероидов DP были изолированы и обнаружены. По сравнению с другими лечебными группами, сфероидный секретом приводил к значительно более высоким уровням экспрессии основного фактора роста фибробластов (bFGF) и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 2 (TIMP2; фиг. S6). Изображения, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии (FEI Talos F200X), показали морфологию экзосом (рис.5Б). Средний размер экзосом, полученных из DP-клеток (DP-XOs), составлял около 180 нм, а средний размер экзосом, производных DP-сфероидов (DP spheroid-XOs) был около 130 нм (Fig. 4C). На рисунке S7 показаны идентифицирующие производители экзосом: Alix, CD9 и CD81. Чтобы сравнить содержание miRNA в экзосомах, мы выполнили массивы miRNA и обнаружили, что DP spheroid-XOs экспрессируют miR-218-5p на значительно более высоких уровнях, чем DP-XOs (Fig. 5D and Fig. S8).

( A ) Схема, иллюстрирующая, как сфероиды DP способствуют переходу цикла волос от катагена к телогену посредством миграции и секреции факторов и экзосом. В анагене обильный источник растущих клеток DP находится внутри выпуклости фолликула. ДП клетки падают во время катагена. Пополнение DP-клеток способствует наступлению анагена. (От B до E ) Характеристика 2D DP-XO и 3D DP-XO. (B) изображения ПЭМ. Экзосомы обозначены желтыми стрелками. Масштабные линейки 500 мкм.(C) Распределение по размерам с помощью NanoSight. (D) 10 лучших микроРНК с повышенной активностью и 10 отрицательной регуляции miRNA 3D DP-XO по сравнению с 2D DP-XO. ( n = 3 биологических повтора и n = 3 технических повтора для каждого биологического повтора). (E) Схема, иллюстрирующая регуляцию волосяных фолликулов, управляемую FGF2 и TIMP2, и индуцированное miR-218-5p стимулирование развития волосяных фолликулов.

Как показано на рис. 5E, bFGF может приниматься связанным с клеточной мембраной FGFR и повышать экспрессию p-Erk ^1/2 , который регулирует экспрессию β-катенина ( 38 ) .Известно, что TIMP2 ингибирует экспрессию матриксной металлопротеиназы 2 (MMP2) ( 39 ), что может препятствовать миграции и пролиферации клеток DP ( 40 ). Однако механизм, лежащий в основе MMP2-опосредованной регуляции волосяных фолликулов, все еще не ясен и требует дальнейшего изучения. Факторы роста участвуют в стимулировании циклов роста волос, и механизм bFGF был продемонстрирован ранее ( 41 , 42 ). Уровни bFGF и TIMP2 были приблизительно удвоены в секретоме сфероидов по сравнению с секретомом 2D клеток.Кроме того, miR-218-5p в 3D DP-XOs была повышена в 25 раз по сравнению с 2D DP-XOs. Таким образом, определение того, как экзосомы регулируют этот процесс, и важность miR-218-5p в опосредовании цикла роста волос были основной целью этого исследования.

Обработка экзосом на основе сфероидов DP для возобновления роста волос

Клеточная терапия — многообещающий шаг вперед в достижении новообразования волосяных фолликулов. Однако использование клеточных компонентов в качестве терапевтических катализаторов могло бы сделать еще более удобный терапевтический продукт, исключив клетку как терапевтический носитель.И экзосомы, и секретомы могут вносить вклад в процесс роста волос, тогда как дифференциально экспрессируемая miR-218-5p в экзосомах может вносить вклад в более высокую эффективность 3D сфероидов в стимулировании роста волос по сравнению с 2D клетками DP. Также, согласно литературе, miR-218-5p непосредственно нацелен на SFRP2 и, таким образом, он активирует путь WNT / β-catenin ( 43 ). Таким образом, активированные экзосомы miR-218-5p были основным объектом исследования в данном исследовании.

Рекрутирование клеток DP в волосяной фолликул имеет решающее значение для возобновления роста волос ( 44 ).Мы продемонстрировали, что происходящие из сфероидов экзосомы могут эффективно способствовать миграции DP по сравнению с экзосомами из 2D-клеток (рис. S9), а повышенная подвижность клеток также может быть важна для их агрегирования и поведения миграции in vivo ( 45 ). Затем были проведены исследования in vivo на мышах C57BL / 6. Экзосомы вводили на одну сторону дорсальной кожи (фиг. 2A) и сравнивали с 5% -ным местным лечением миноксидилом. При морфологическом наблюдении (рис. 6А) и соответствующей количественной оценке (рис.6B), терапевтическая эффективность 2D DP-XO существенно не отличалась от таковой миноксидила, в то время как 3D DP spheroid-XOs ускоряли рост волос до степени, сравнимой с обработкой клетками. Чтобы изучить изменения экспрессии SFRP2 и β-катенина в коже после лечения, мы собрали образцы кожи дорсальной части из разных групп на 15-й день. Иммуноокрашивание подтвердило, что экспрессия β-катенина была увеличена в группах, получавших DP spheroid-XOs по сравнению с пациенты, получавшие 2D DP-XOs или миноксидил.DP spheroid-XOs могут регулировать циклы роста волос путем подавления SFRP2 и повышения уровня β-catenin (Fig. 6, C и D). Поскольку miR-218-5p непосредственно нацелен на SFRP2, миметики и ингибиторы miR-218-5p были использованы для дальнейшего подтверждения важности обогащения miR-218-5p.

( A ) Мышей разделили на три группы ( n = 4) и лечили с левой стороны. Мышей снимали на 10-й и 15-й дни соответственно.( B ) Соответствующий анализ покрытия волос в разных группах. Были записаны как левая, так и правая стороны. 3D DP-XO способствовали росту волосяных фолликулов более эффективно, чем миноксидил и 2D DP-XO. n = 4; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001. ( C ) Определение стоимости иммунофлуоресценции SFRP2 (зеленый) и β-катенина (красный) на образцах кожи из разных групп лечения. Ядра окрашивали DAPI (4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол) (синий).Шкала 100 мкм. ( D ) Количественная оценка относительной экспрессии SFRP2. n = 5; **** П <0,0001. ( E ) Типичных мышей, визуализированных на 20-й день после инъекции отрицательного контроля, миметиков miR-218-5p и ингибиторов, соответственно. Красные кружки обозначают места инъекций. На месте укола есть небольшая проплешина, что означает, что способ доставки требует доработки. ( F ) Количественная оценка уровня покрытия волос (%) в трех группах на 15 день. n = 4; * P <0,05 и ** P <0,01. ( G ) активируемые экзосомы miR-218-5p и миметики miR-218-5p, доставляемые посредством in vivo-jetPEI, могут трансфицировать miR-218-5p для нацеливания на SFRP2 и, таким образом, повышать регуляцию пути WNT / β-катенина; Ингибитор miR-218-5p в определенной степени блокирует эту передачу сигналов. Фото: S.H., Государственный университет Северной Каролины.

miR-218-5p играет решающую роль в опосредованном экзосомами возобновлении роста волос

Одной из основных проблем при лечении miRNA является доставка.Модель in vitro не точно отражает, играет ли miR-218-5p важную роль в регуляции роста волосяных фолликулов при рассмотрении различных типов клеток в фолликулах ( 46 ). Здесь миметик mmu-miR-218-5p был смешан с раствором полиэтиленимина (PEI) (in vivo-jetPEI; Polyplus Transfection, Illkirch, France) в соответствии с инструкциями производителя. Раствор полиплекса PEI / отрицательный контроль, PEI / миметики или PEI / ингибиторы раствор полиплекса (10 мкл на участок) осторожно вводили подкожно в кожу спины депилированных мышей (рис.6E). Нацеливаясь на SFRP2, имитаторы miR-218-5p способствовали развитию волосяных фолликулов, тогда как ингибиторы miR-218-5p ингибировали начало фазы анагена в цикле волосяных фолликулов. Мы можем видеть заметные эффекты возобновления роста волос при лечении миметиком miR-218-5p по сравнению с контрольной группой и ингибиторами miR-218-5p. Однако эти эффекты (от 50 до 90% покрытия волос) были менее сильными, чем эффекты от лечения экзосомами (от 95 до 100% покрытия волос) на 20 день. Мы полагаем, что это связано с тем, что экзосомы содержат различные miRNA и белки, а miR- 218-5p — не единственный (хотя и очень важный), который способствовал росту волос.

Мы использовали другую стратегию для стимулирования роста волос. Как показано на фиг. 6G, как загруженные miR-218-5p экзосомы, так и миметики miR-218-5p, инкапсулированные in vivo PEI, способствовали транскрипту miR-218-5p. Генетическая структура miR-218-5p показала, что он непосредственно нацелен на SFRP2. Чтобы продемонстрировать регуляторный эффект, который miR-218-5p и передача сигналов WNT оказывают на цикл роста волос, мы исследовали медиаторы транскрипции, SFRP2 и β-катенин с помощью вестерн-блоттинга. Образцы кожи (день 15) показали, что miR-218-5p имитирует устойчиво увеличенную экспрессию эндогенного β-катенина, тогда как обработка ингибиторами miR-218-5p показала снижение экспрессии β-катенина (рис.S10).

Вместе эти данные подтверждают теорию о том, что основной терапевтический путь включает стимуляцию передачи сигналов WNT сверхэкспрессируемыми экзосомами miR-218-5p посредством подавления SFRP2, ингибитора передачи сигналов WNT, и повышения регуляции β-катенина. .

ОБСУЖДЕНИЕ

Учитывая временную эффективность финастерида и миноксидила, а также ограниченное количество доступных методов лечения, необходимо срочно открыть новые методы лечения для предотвращения выпадения волос и ускорения их роста ( 47 ).Альтернативные решения проблематичны, особенно биопродукты.

Пополнение DP-клеток культивированными in vitro клетками DP является разумным подходом для управления переходом телоген-анаген в цикле волосяного фолликула. Однако клетки DP со временем теряют способность вызывать образование волос, если их культивировать на плоской пластиковой поверхности. Хорн с соавторами ( 48 ) наблюдали, что культивируемые клетки DP (более шести пассажей) не могли вызвать переход волосяных фолликулов в анаген после имплантации in situ.Клетки DP должны агломерироваться в луковице волосяного фолликула, чтобы способствовать фолликулогенезу ( 49 , 50 ). Osada et al. показали, что клетки DP восстановили свою индуктивную способность волосяных фолликулов после того, как они культивировались в суспензии в виде сфероидов ( 14 ). В нашем исследовании мы подтвердили более высокую экспрессию CD133 и β-катенина в сфероидах DP по сравнению с клетками DP, что означает, что сфероиды DP могут проявлять лучшую способность к индукции роста волос in vivo.

Секретом сфероидов DP также отличается от секрета диссоциированных клеток.Исследователи показали, что дермальные сферы морфологически сродни клеткам DP в фазе анагена с профилями экспрессии, отличными от 2D-клеток, но очень похожими на интактные клетки DP ( 51 ). Доказательств того, как пересаженные волосяные фолликулы влияют на окружающую среду в области лысины и паракринные эффекты, было недостаточно. Наши исследования продемонстрировали, что клетки DP проявляют свою регулирующую способность в отношении цикла волос в основном через паракринный механизм. Экспрессия β-катенина повышалась не только в местах инъекции, но также и в необработанных сайтах.Клетки DP выделяют различные факторы роста и везикулы для регулирования биологии фолликулов, и было установлено, что культивирование в сфероидах наиболее эффективно сохраняет исходный фенотип этих клеток in vitro. Вместо того, чтобы вводить больше клеток DP для накопления в волосяных фолликулах, вводили экзосомы для регулирования циклов волосяных фолликулов. Экзосомы, происходящие из сфероидов, с более высоким уровнем miR-218-5p по сравнению с 2D DP-XOs, также усиливали экспрессию β-катенина и подавляли SFRP2, который положительно регулировал рост волосяных фолликулов и поддерживал фазу анагена волос. цикл.

Мыши C57BL / 6 являются полезными моделями для скрининга агентов, которые способствуют росту волос, поскольку их кожа производит пигмент только во время фазы анагена ( 52 ). Выпадение волос у человека имеет гормональные, экологические и генетические причины. Из-за своей сложности клеточная или секретомная терапия может быть более предпочтительной при лечении выпадения волос по сравнению с миноксидилом, поскольку основным терапевтическим механизмом миноксидила является усиление кожного кровотока к обрабатываемому участку. Повышенный кровоток вызывает гиперполяризацию клеточных мембран, позволяя большему количеству питательных веществ достигать фолликулов и клеток.Однако, если клетки DP остаются в спящем состоянии, вероятно, произойдет небольшое возобновление роста волос. В этом исследовании мы продемонстрировали, что сфероиды управляют циклом роста волос от телогена до анагена у здоровых мышей. Модели, связанные с заболеванием, или модели облысения, связанные с гормонами, необходимы для полной демонстрации преимуществ терапии экзосомами по сравнению с миноксидилом. Еще одно ограничение этого исследования заключается во взаимодействии экзосом с фолликулярными клетками. Мы сосредоточились на исследованиях на животных, а не на клеточных исследованиях, потому что мы не были уверены, какие типы клеток фолликулов регулируются.Для изучения механизмов в будущем необходимы дополнительные исследования клеток.

В совокупности мы продемонстрировали, что сверхэкспрессированные miR-218-5p экзосомы ускоряют начало анагена, а культура сфероидов предоставляет потенциальные возможности для клеточной терапии. miR-218-5p регулирует развитие волосяного фолликула путем подавления ингибитора передачи сигналов WNT SFRP2, тем самым стимулируя β-катенин, создавая петлю положительной обратной связи. Наше исследование может предложить следующие преимущества по сравнению с существующей практикой регенерации волос.Для людей, не подходящих для инвазивных хирургических процедур, они могут получить пользу от введения факторов и экзосом с помощью минимально инвазивного подхода, например безыгольной инъекции ( 23 ), пластырей с микроиглами ( 53 — 55 ), и спреи ( 56 , 57 ). По сравнению с коммерчески доступным миноксидилом экзосомы представляют собой натуральный продукт с меньшим количеством побочных эффектов. В целом, описанные здесь исследования могут представлять новые терапевтические стратегии лечения волос.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение клеток DP от мышей C57BL / 6

Подушечки вибрисс были отрезаны от умерщвленных мышей C57BL / 6 ( 27 ), а затем промыты в PBS три раза. Волосяные фолликулы рассекали и инкубировали с 0,25% диспазой (STEMCELL Technologies) в течение 20 мин в инкубаторе. Затем над ДП был сделан горизонтальный разрез. Затем луковицы волосяных фолликулов переносили в чашку, покрытую коллагеном I (Sigma-Aldrich) из хвоста крысы. Мы использовали минимальную эссенциальную среду Игла (MEM; Gibco), 10% фетальную бычью сыворотку (FBS; Corning), 1% пенициллин-стрептомицин и bFGF (10 нг / мл; Fisher Scientific) в качестве среды DP до тех пор, пока клетки DP не вырастут из луковиц. примерно через 3 дня.Затем луковицы волосяных фолликулов промывали и помещали в свежую среду. Клетки DP достигли слияния через 1 неделю.

Культура двумерных клеток и трехмерных сфероидов

Для двумерных культур для пассажа использовали колбы, покрытые коллагеном I. Для этого исследования использовали пассажи с 3 по 6 клетки DP. Для 3D-культуры клетки DP высевали в 96-луночный планшет со сверхнизким прикреплением (Corning, 5 × 10 ⁴ на лунку) для подсчета количества сфероидов. Сфероиды формировались через 2 дня после посева. В исследовании на животных использовали сфероиды с 5-го по 7-й день.

DP [MEM, 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицин и bFGF (10 нг / мл)] использовали для культивирования клеток. Для сбора секретома или экзосом среду DP заменяли на основную среду MEM (без FBS), как только клетки достигли 80% слияния. Затем кондиционированную среду собирали через 3 дня ( 23 ).

Выделение и анализ секретома и экзосом

Секретом концентрировали с помощью центробежных фильтров Amicon Ultra-15 (отсечка 3 кДа) и один раз промывали PBS. Экзосомы концентрировали с помощью центробежных фильтров Ultra-15 (отсечка 100 кДа) и один раз промывали PBS.

Мышиный массив ангиогенеза (RayBio) и miRNA PCR (полимеразная цепная реакция) Array Mouse miFinder (Qiagen) использовали в соответствии с инструкциями производителя.

Приготовление кератиновых гидрогелей

Кератиновые гидрогели получали согласно предыдущей публикации с модификациями ( 6 ). Вкратце, человеческие волосы (местный парикмахер) промывали водой, а затем разрезали на мелкие кусочки. Затем фрагменты волос обрабатывали 2,5% (мас. / Об.) Перуксусной кислотой в течение ночи, а затем тщательно промывали проточной водой.Фрагменты волос погружали в 150 мМ трис-основу на 2 часа для экстракции белков. Затем после удаления волокон через сито 40 мкм получали прозрачный раствор. Этот раствор очищали диализом против деионизированной воды (с мембраной для диализа с молекулярной отсечкой 3 кДа; Fisher Scientific) и сушили вымораживанием (лиофилизировали). Полученное лиофилизированное твердое вещество дополнительно измельчали ​​в тонкий порошок. Пятнадцать процентов кератиновых гидрогелей (мас. / Об.) Получали восстановлением мелкодисперсного порошка с помощью PBS. Сфероиды диспергировали в растворе кератина и оставляли в инкубаторе при 37 ° C на ночь, пока кератин образовывал гидрогель.

Сканирующая электронная микроскопия

Морфологию гидрогеля визуализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Образцы фиксировали 2% глутаровым альдегидом, а затем дегидратировали в градиентном этаноле, последовательно, в течение 10 минут каждый. Затем их сушили в гексаметилдисилазане (Sigma-Aldrich). Перед визуализацией гели были покрыты золотом напылением (JEOL 6010LA SEM, JEOL Ltd., Япония).

Животные и исследования in vivo

Семинедельные самцы мышей C57BL / 6 были приобретены в лаборатории Джексона и им позволили адаптироваться к новой среде в течение 1 недели.Волосы удаляли с помощью крема для депиляции для наблюдения за розовой кожей ( 10 ). Затем животные были случайным образом разделены на группы ( n = 5) для изучения возобновления роста волос. Миноксидил применяли местно ежедневно в качестве положительного контроля. Все остальные виды лечения вводились подкожно. Вся работа с мышами проводилась в соответствии с Комитетом по уходу и использованию животных в Университете штата Северная Каролина.

Доза обработки клеток: 1,0 × 10 ⁶ клеток в 200 мкл PBS вводили подкожно в 10 пятен (20 мкл на участок) на левой стороне дорсальной кожи.

Обработочная доза экзосом: 2,0 × 10 ⁹ экзосом в 200 мкл PBS вводили подкожно в 10 точек (20 мкл на участок) на левой стороне кожи спины.

Отрицательный контроль, миметики miR-218-5p и ингибиторы (Sigma-Aldrich) вводили согласно протоколу, предоставленному in vivo-jetPEI (Polyplus-transfection). Вкратце, мышам делали по 10 инъекций на каждую депилированную кожу спины. Миметик miRNA (400 нг) или ингибитор растворяли в 90 мкл 5% раствора глюкозы (мас. / об.), а затем добавляли 10 мкл раствора in vivo-jetPEI.Раствор немедленно перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре перед инъекцией. Контрольным группам вводили мимический контроль.

Гистология кожной ткани

Мышей умерщвляли и удаляли всю спинную кожу. Кожную ткань фиксировали в 4% параформальдегиде, а затем криостатом разрезали на срезы толщиной 5 мкм. H&E и трихром по Массону окрашивали согласно протоколам. Для гистохимии иммунофлуоресценции в качестве первичных антител использовали мышиные анти-β-катенин (Abcam, ab6301), кроличьи анти-CD133 (ab19898), кроличьи анти-Ki67 (ab16667) и кроличьи анти-SFRP2 (ab137560).В качестве вторичных антител использовали козий антимышиный иммуноглобулин G (IgG; Alexa Fluor 488; ab150113), козий антикроличий IgG (Alexa Fluor 488; ab150077) и козий антимышиный IgG (Alexa Fluor 555; ab150114).

Вестерн-блот

Образцы загружали и сравнивали со стандартной лестницей (Precision Plus Protein Standards, Bio-Rad). Первичные антитела были следующими: мышиный анти-β-катенин (Abcam, ab6301), кроличий SFRP2 (ab137560), анти-Erk1 (pT202 / pY204) + Erk2 (pT185 / pY187) [MAPK-YT] (ab50011), анти- ERK1 + ERK2 (ab17942) и анти-GAPDH [пероксидаза хрена (HRP)] (ab9482).Использовали козий антимышиный IgG (HRP) (ab205719) и козий антикроличий IgG (HRP) (ab205718).

Статистический анализ

Все количественные эксперименты проводили в трех повторностях, если не указано иное. Данные были показаны в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего и проанализированы с помощью двустороннего непарного теста Стьюдента t для сравнения между двумя группами. Сравнение данных между более чем двумя группами проводилось с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони.Данные между сгруппированными данными анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Статистически значимыми считались различия со значением P менее 0,05.

Выражение признательности: Эта работа была частично выполнена в Центре аналитических приборов (AIF) в Университете штата Северная Каролина, который поддерживается штатом Северная Каролина и NSF (номер награды ECCS-1542015). В этой работе использовались приборы AIF, приобретенные при поддержке NSF (DMR-1726294).AIF является членом Сети нанотехнологий исследовательского треугольника Северной Каролины (RTNN), сайта в рамках Национальной скоординированной инфраструктуры нанотехнологий (NNCI). Финансирование: Эта работа финансировалась грантами NIH (R01 HL123920, HL137093, HL144002 и HL146153 для К.С.) и Американской кардиологической ассоциации (18TPA34230092 и 19EIA34660286 для К.С.). Вклад авторов: K.C. и С. разработал исследование. S.H. и З.Л. проводил эксперименты. S.H., H.L., K.H., T..S., J.C. и P.-U.C.D. проанализировал результаты и написал рукопись. J.C. закончил грамматические правки. Все авторы внесли свой вклад в общую научную интерпретацию и отредактировали рукопись. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Микроинкапсулированные антоцианы шелковицы способствуют усвояемости сывороточных белков in vitro в гликозилированных моделях энергетических шариков.

Основные моменты

•

Антоцианы шелковицы фактически способствовали перевариванию энергетических шариков после хранения.

•

Антоцианы шелковицы частично раскрывают вторичную структуру сывороточных белков.

•

Нековалентное связывание произошло между антоцианом шелковицы и сывороточным протеином.

Abstract

Изучено влияние антоцианов шелковицы (МА) на усвояемость сывороточных белков (WP) в свежеприготовленных и сохраненных энергетических шарах. Результаты показали, что МА увеличивают перевариваемость энергетических шаров за счет увеличения степени их гидролиза, фракций растворимых пептидов и уменьшения размера их частиц и агломерации. Поэтому, чтобы понять механизм стимулирования и / или ингибирования пищеварительных эффектов МА, были измерены вторичные структурные изменения и связывание смесей WP-MA.Результаты показали, что МА могут нековалентно / ковалентно взаимодействовать с WP и образовывать WP-MA-аддукты. Это взаимодействие, по-видимому, отвечало за изменения во вторичной структуре WP, которые впоследствии могли способствовать усвояемости энергетических шаров. МА также частично разворачивали структуру переваренных WP посредством колебания их α-спирали и β-листа. Был сделан вывод, что разворачивание WP-структуры, индуцированное взаимодействиями МА, может увеличить доступность пептидных связей для пищеварительных ферментов и, как следствие, облегчить перевариваемость белка в энергетических шарах.

Сокращения

Молекулярно-динамическое моделирование

Тандемная времяпролетная масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией и ионизацией

Расщепление in vitro

Характеристики переваренного пептида

Связывание сывороточного протеина с антоцианом

Изменения вторичной структуры

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

© 2020 Elsevier Ltd.Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

О продвижении использования не по назначению | Закон о лекарствах и устройствах

Мы публиковали больше раз, чем мы можем рассчитывать, в поддержку позиции, что производители, регулируемые FDA, должны иметь возможность участвовать в правдивой «рекламе» использования своих продуктов не по назначению. Итак, по общенациональному телевидению — и в присутствии комиссара FDA — 19 марта 2010 г. президент Соединенных Штатов выступил с заявлением о том, что лекарство, отпускаемое по рецепту, гидроксихлорохина сульфат (фирменное наименование: Плаквенил), не по назначению. COVID-19. См. Видео на 12: 18-14: 56. Мы не будем заходить так далеко, чтобы называть продвижение «правдивым», потому что мы, откровенно говоря, не знаем, и президент сделал множество других заявлений на пресс-конференциях, которые позже были прояснены, уточнены, отклонены или иным образом изменены в ближайшее время. потом его официальными лицами.

Действительно, FDA разъяснило, что любое предположение о том, что гидроксихлорохин был одобрен для лечения COVID-19, было ложным, хотя оно пообещало продолжить рассмотрение этого и других препаратов в качестве возможных методов лечения COVID-19.В другом месте эксперты в области здравоохранения широко заявляли, что, несмотря на некоторые интересные результаты in vitro , нет никаких доказательств того, что этот препарат (который имеет значительные риски, включая опасные для жизни сердечно-сосудистые расстройства) имеет клинически значимое различие в качестве противовирусного средства в любом из них. животные или люди.

Hydroxychloroquine существует уже давно, и в настоящее время почти полностью универсален, но его одобренная FDA маркировка имеет только одно предполагаемое использование:

ПОКАЗАНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Малярия

ПЛАКВЕНИЛ показан для лечения неосложненной малярии, вызванной P.falciparum, P. malariae, P. ovale и P. vivax.

ПЛАКВЕНИЛ показан для профилактики малярии в географических районах, где не сообщается о резистентности к хлорохину.

Маркировка FDA на второй-третьей ненумерованной странице.

FDA не регулирует терапевтическое использование одобренных лекарств (и медицинских устройств) для состояний, отличных от тех, для которых такие лекарства отмечены. «Использование маркировки [O] ff является общепринятым» в соответствии с законом как «необходимое следствие миссии FDA по регулированию в этой области без прямого вмешательства в медицинскую практику.” Buckman Co. против Юридического комитета истцов , 531 U.S. 341, 350 (2001). Таким образом, «врачи могут прописывать лекарства и устройства для использования не по назначению». ид. , стр. 351 и № 5. Действительно, в другом месте того же пресс-релиза FDA также заявило:

Распространение информации о многообещающих применениях лекарств не по назначению, которые у нас уже есть, исследование их эффективности и поиск других терапевтических средств поможет американским поставщикам медицинских услуг инструменты, необходимые для спасения жизней.

Мы действительно согласны с президентом, что является редким случаем, что текущие ограничения FDA на правдивую рекламу вне лейбла являются «устаревшими правилами» (видео на 9: 16-: 18) и создают «ненужные» барьеры (видео на 9: 29- : 32) к передаче медицинской информации.

Другой препарат, ремдесивир, также упоминался (видео, 14: 46-15: 50) как предположительно «одобренный по существу».